Высвобождение дофамина в пресинаптические терминалы Индивидуальные Визуализированные с FFNs

Флуоресцентный ложный нейромедиатор. FFN 511 представляет собой флуоресцентный моноамин, который при применении к срезам мозга может выступать в качестве субстрата для синаптического физического транспортера моноаминов. FFN 511 захватывается дофаминергическими синаптическими везикулами через транспортер моноаминов и может быть использован для визуализации высвобождения медиатора непосредственно из пресинаптических окончаний моноаминергических нейронов, например, в слое S. Высвобождение медиатора из окончаний в срезе визуализируется как снижение интенсивности точечных флуоресцентных сигналов.

В данном видео демонстрируется приготовление корональных срезов сагиттального отдела мозга толщиной 250 мкм с использованием вибратома, окрашивание с помощью FFN 511 и получение изображений с помощью многофотонного лазерного микроскопа. Представлены эксперименты по детектированию, которые выявляют частотно-зависимую гетерогенность высвобождения iCal. Здравствуйте, я HU из лаборатории Дэвида на факультете неврологии Колумбийского университета.

Здравствуйте, я Минерва, также из лаборатории Солджера. Сегодня мы продемонстрируем процедуру маркировки дофаминергических терминалей в срезах мозга с помощью флуоресцентных ложных нейромедиаторов. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения высвобождения дофамина.

Итак, приступим. Перед приготовлением острых срезов сагиттальных (sal) срезов необходимо оксигенировать искусственную спинномозговую жидкость (A CSF) и охлаждать ее на льду. В течение как минимум 15 минут до извлечения мозга поддерживайте A CSF в охлажденном и оксигенированном состоянии. Во время диссекции извлеките весь мозг мыши и закрепите его на подложке вибратома, приклеив к ней с помощью суперклея. Извлечение и закрепление мозга должны быть выполнены в течение двух минут.

Заполните кювету охлажденным оксигенированным A CSF, в котором подготовлены корональные срезы мозга толщиной 250 мкм в диапазоне от +1,54 до +0,62. Будет получено 3 целых среза, которые можно разделить на шесть половин с помощью иглы. Инкубируйте срезы мозга в оксигенированном A CSF при комнатной температуре не менее одного часа; в течение этого времени срезы мозга должны находиться в процессе инкубации.

В оксигенизированном A CSF приготовьте загрузочный раствор FFN 511 с концентрацией 10 micromolar, добавив стоковый раствор FFN 511 с концентрацией 10 millimolar в A CSF. После этого приготовьте раствор A-D-V-A-S-E-P seven с концентрацией 100 micromolar в A CSF. Оксигенизируйте оба раствора в течение не менее 15 минут перед индивидуальным введением в срезы. Инкубируйте каждый срез мозга с загрузочным раствором FFN 511 в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем удалите Di, связавшийся с внеклеточной тканью, путем инкубации нагруженного среза в оксигенированном 100 µM advers, seven A CSF в течение 30 минут при комнатной температуре. Теперь срезы готовы к визуализации. Окрашивание FFN 511 в срезах будет визуализировано с помощью многофотонного лазерного сканирующего микроскопа Prairie Ultima. Поместите нагруженный FFN 511 срез в записывающую камеру и перфузируйте оксигенированным A CSF со скоростью потока 1–2 мл/мин. Затем поместите платиновую арфу с нейлоновыми струнами поверх среза, чтобы минимизировать его смещение.

Для дальнейшей минимизации смещений в ходе эксперимента перед началом визуализации дайте срезам стабилизироваться в камере в течение не менее 10 минут. Визуализируйте и определите положение спинной области AUM с помощью люминесценции в светлом поле под иммерсионным объективом 10x; поместите и зафиксируйте биполярные скрученные вольфрамовые электроды в этой области для проведения эксперимента по стимуляции. Область визуализации в состоянии покоя находится в пределах 300 micrometers.

Расположите данную область в центре изображения поля зрения FFN 511, где отмечены терминали Sal, между двумя концами стимулирующего биполярного электрода, используя 63-кратный иммерсионный объектив для ультрафиолетового излучения. Возбуждение FFN 511 осуществляется на длине волны 760 нанометров с помощью лазера Mi.Tai от Spectral Physics. Оптимальная флуоресценция терминалей Sal наблюдается через полосовой фильтр; захват изображений производится в 12-битном формате с областями интереса размером 75 by 75 микрометр при разрешении 512 by 512 пикселей. Здесь представлен пример изображения с терминалями дофамина Sal, помеченными FFN 511.

Метка FFN 511 может быть вымыта либо высокими концентрациями амфетамина сульфата калия хлорида, либо путем электрической стимуляции в эксперименте по вымыванию калия хлорида; при нанесении на срез мозга раствора СМЖ с высоким содержанием калия метка FFN 511 вымывается в течение четырех минут. Регистрируйте XYZT-изображения, чтобы отслеживать вымывание FFN 511 с течением времени при окрашивании FFN 511 методом электрической стимуляции. Получите контрольную серию изображений среза до стимуляции в течение как минимум пяти минут, чтобы убедиться в минимальном смещении среза и отсутствии фотообесцвечивания лазером после получения контрольных изображений.

Продолжайте XYZT-визуализацию, начав стимуляцию с частотой 1, 4 или 20 Гц; стимулы подаются локально в стриатум с помощью изолятора стимулов Isoflex, управляемого генератором импульсов Master-8, с использованием биполярных электродов. В данном видео показано распределение FFN 511 во время экзоцитоза в срезе мозга SAL. Подготовка: после завершения загрузки FFN 511 в SAL наблюдается интенсивное мечение в стриатуме, редкое мечение в коре и отсутствие мечения в мозолистом теле.

Селективную маркировку дофаминовых терминалей можно деполяризовать с помощью хлорида калия, что показано на этих репрезентативных изображениях до введения хлорида калия и через две минуты после применения 70 мМ хлорида калия. Деполяризация маркировки FFN 511 в ЦНС также может быть достигнута с помощью амфетамина. На данном изображении показана маркировка FFN 511 в стриатуме до введения амфетамина.

В то время как на данном изображении показан стриатум через 20 минут после детеншинга с использованием 20 µM амфетамина, детеншинг маркировки FFN 511 при локальной электрической стимуляции проиллюстрирован на этих изображениях, демонстрирующих маркировку FFN 511 в стриатуме до стимуляции, а также через 217 секунд и 514 секунд после начала стимуляции с частотой 4 Hz. Этот график нормализованной интенсивности флуоресценции в зависимости от времени показывает, что детеншинг FFN 511 зависит от кальция и частоты; контроли, обозначенные незакрашенными треугольниками, не подвергались стимуляции. Детеншинг с хлоридом кадмия, обозначенный незакрашенными кругами, был идентичен нестимулированным контролям.

Кривые затухания для каждой частоты стимуляции, представленные цветными кругами, были аппроксимированы функцией одноэкспоненциального затухания, а значения периода полураспада были рассчитаны как tau, умноженное на 0.693. Мы только что продемонстрировали вам, как вводить флуоресцентный нейромедиаторный сенсор FFN 511 в дофаминергические терминали в остром срезеnucleus accumbens и как высвобождать его с помощью высокого содержания калия и вызывать стимуляцию. Это первый метод, разработанный для оптического исследования высвобождения нейромедиаторов на уровне отдельных синаптических терминалей.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать жизнеспособность срезов, а также учитывать время загрузки, фоновое обесцвечивание и артефакты движения; срезы демонстрируют хорошее качество FFN five 11 при загрузке и визуализации в течение четырех часов после подготовки. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.