Высвобождение дофамина в пресинаптические терминалы Индивидуальные Визуализированные с FFNs

Флуоресцентный ложный нейромедиатор. FFN 511 представляет собой флуоресцентный моноамин, который при применении к срезам мозга может служить субстратом для синаптического физического транспортера моноаминов. FN 511 захватывается дофаминергическими синаптическими везикулами через транспортер моноаминов и может быть использован для визуализации высвобождения медиатора непосредственно из пресинаптических терминалей моноаминергических нейронов, например, расположенных в S-слое. Высвобождение медиатора из терминалей в срезе визуализируется как уменьшение точечных флуоресцентных сигналов.

В данном видео представлены срезы коры головного мозга толщиной 250 мкм, подготовленные с помощью вибратома, окрашенные FFN 511 и визуализированные с использованием многофотонного лазерного микроскопа. Продемонстрированы эксперименты по детекции, которые выявляют частотно-зависимую гетерогенность высвобождения iCal. Здравствуйте, я ХУ из лаборатории Дэвида на факультете неврологии Колумбийского университета.

Здравствуйте, я Минерва, также из лаборатории Солджер. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру маркировки дофаминовых терминалей в срезах мозга с помощью флуоресцентных ложных нейротрансмиттеров. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения высвобождения дофамина.

Приступим к работе. Перед подготовкой острых срезов сагиттальных структур необходимо насытить искусственную спинномозговую жидкость (иСМЖ) кислородом и охладить ее на льду минимум за 15 минут до извлечения мозга. В течение всего процесса диссекции иСМЖ должна оставаться ледяной и насыщенной кислородом. Извлеките весь мозг из головы мыши и закрепите его на вибротоме, используя цианоакрилатный клей. Извлечение и закрепление мозга должны быть выполнены в течение двух минут.

Заполните кювету охлажденным оксигенированным A CSF, поместив туда корональные срезы мозга или срезы мозга толщиной 250 micrometer в диапазоне от +1,54 до +0,62. Будет получено три целых среза, которые можно разделить на шесть половин с помощью иглы. Инкубируйте срезы мозга в оксигенированном A CSF при комнатной температуре не менее одного часа; в течение этого времени срезы мозга будут инкубироваться.

В оксигенизированной A CSF приготовьте 10 мкМ загрузочный раствор FFN 511, добавив 10 мМ стоковый раствор FFN 511 в A CSF. После этого приготовьте 100 мкМ раствор A-D-V-A-S-E-P 7 в A CSF. Оксигенизируйте оба раствора в течение не менее 15 минут перед индивидуальным введением в срезы. Инкубируйте каждый срез мозга с загрузочным раствором FFN 511 в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем удалите DI, связанный с внеклеточной тканью, инкубируя нагруженный срез в оксигенированном 100 µM ADVERS, семь A CSF в течение 30 минут при комнатной температуре. Теперь срезы готовы к визуализации. Окрашивание FFN 511 будет визуализировано в срезах с помощью многофотонного лазерного сканирующего микроскопа Prairie Ultima. Поместите нагруженный FFN 511 срез в измерительную камеру и перфузируйте оксигенированным A CSF со скоростью потока 1–2 мл/мин. Затем поместите платиновую арфу с нейлоновыми струнами поверх среза, чтобы минимизировать его движение.

В ходе эксперимента для дополнительной минимизации смещений дайте срезам стабилизироваться в камере в течение не менее 10 минут перед началом визуализации. Визуализируйте и найдите дорсальную полоску AUM с помощью светлого поля; используя объектив с жидкостным погружением 10x, установите биполярные скрученные вольфрамовые электроды в этой области для проведения эксперимента по стимуляции. Область визуализации в режиме ожидания расположена в пределах 300 мкм.

Поместите область с терминалями SAL, помеченными FFN 511, в центр изображения поля зрения между двумя наконечниками стимулирующего биполярного электрода, используя 63-кратный иммерсионный ультрафиолетовый объектив. Возбуждение FFN 511 осуществляется на длине волны 760 нанометров с помощью лазера MiTai от Spectral Physics. Оптимальная флуоресценция терминалей SAL наблюдается через полосовой фильтр; захват изображений проводится в 12-битном формате с областями интереса размером 75 by 75 микрометров при разрешении 512 by 512 пикселей. Здесь представлен пример изображения дофаминовых терминалей SAL, помеченных FFN 511.

Метка FFN 511 может быть удалена либо высокими концентрациями сульфата амфетамина с хлоридом калия, либо путем электрической стимуляции; в эксперименте по удалению метки хлоридом калия при нанесении на срез мозга раствора ЦСЖ с высоким содержанием калия метка FFN 511 удаляется в течение четырех минут. Регистрируйте XYZT-изображения для отслеживания динамики удаления FFN 511 во времени при окрашивании FFN 511 с помощью электрической стимуляции. Получите контрольный временной ряд изображений среза до стимуляции в течение как минимум пяти минут, чтобы убедиться в минимальном смещении среза и отсутствии фотообесцвечивания лазером после получения контрольных изображений.

Продолжайте XYZT-визуализацию, начав стимуляцию на частотах 1, 4 или 20 Гц; стимулы подаются локально в стриатум с помощью изолятора стимулов Isoflex, управляемого генератором импульсов Master-8, с использованием биполярных электродов. В данном видео показано перемещение FFN 511 во время экзоцитоза в срезе мозга SAL. Подготовка: после завершения загрузки FFN 511 в SAL наблюдается интенсивное мечение в стриатуме, разреженное мечение в коре и отсутствие мечения в мозолистом теле.

Селективную маркировку терминалей дофамина можно вызвать воздействием высокой концентрации хлорида калия, что показано на этих репрезентативных изображениях до введения хлорида калия и через две минуты после применения 70 мМ хлорида калия. Смещение маркировки FFN 511 также может быть достигнуто с помощью амфетамина. На данном изображении показана маркировка FFN 511 в стриатуме до введения амфетамина.

В то время как на этом изображении показан стриатум через 20 минут после детейннинга 20 мкМ амфетамином, детейннинг метки FFN 511 посредством локальной электрической стимуляции проиллюстрирован на этих изображениях, где показана метка FFN 511 в стриатуме до стимуляции, а также через 217 секунд и 514 секунд после начала стимуляции с частотой 4 Гц. Данный график нормализованной интенсивности флуоресценции в зависимости от времени показывает, что детейннинг FFN 511 зависит от кальция и частоты; контроли, обозначенные незакрашенными треугольниками, не подвергались стимуляции. Детейннинг с использованием хлорида кадмия, обозначенный незакрашенными кругами, был идентичен нестимулированным контролям.

Кривые затухания для каждой частоты стимуляции, представленные цветными кругами, были аппроксимированы функцией одного экспоненциального распада, а значения периода полураспада были рассчитаны как tau, умноженное на 0.693. Мы только что продемонстрировали вам, как вводить флуоресцентный нейротрансмиттер FFN five 11 в дофаминовые терминали в остром срезе и как вызывать его высвобождение с помощью высокого содержания калия и стимуляции. Это первый метод, разработанный для оптического исследования высвобождения нейротрансмиттеров на уровне отдельных синаптических терминалей.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать жизнеспособность срезов, а также учитывать время загрузки, фоновое обесцвечивание и артефакты движения; срезы демонстрируют хорошее окрашивание FFN five 11 при загрузке и визуализации в течение четырех часов после приготовления. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.