Аортального кольца Пробирной

Общая цель анализа кольца аорты состоит в том, чтобы создать гибкую экспериментальную систему, в которой кровеносные сосуды прорастают из целых кусочков аорты мыши внутри 3D-матрицы. Это достигается путем предварительного рассечения грудной аорты у мыши, а затем тщательной очистки ее от остатков окружающей ткани. Срезы чистой аорты или аортальных колец помещаются в отдельные лунки 48-луночного планшета, каждый из которых содержит экстракт базального матрикса или BME, отформованный в купола.

Дополнительная капля BME заключает кольцо в 3D-структуру. Матрица может содержать любой экспериментальный реагент по выбору. После инкубации в течение нескольких дней можно наблюдать, как сосуды прорастают из аортальных колец, и можно оценить ангиогенный потенциал исследуемых соединений.

Здравствуйте, я Карен Бейн из лаборатории доктора Э. Льюиса на кафедре клинической биохимии в Университете негатива Беон в Бе-Шеве, Израиль. Сегодня мы покажем вам процедуру исследования кольца аорты у мыши. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения влияния различных материалов на формирование кровеносных сосудов.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, дайте экстракту базовой матрицы или БМЭ оттаять на льду или при четырех градусах Цельсия. После размораживания продолжайте держать BME в холоде, чтобы предотвратить его повторное затвердевание.

В день эксперимента усыпляют шести-семинедельную мышь с помощью стандартной инъекции кетамина и ксилазина, у которых быстро протекает кровотечение через шейные артерии, за которым следует вывих шейного отдела. Начните процедуру с протирания животного 70%-ным этанолом в стерильном ламинарном капюшоне. Далее, во время работы под рассекающим эндоскопом, с помощью стерильных щипцов и диссекционных ножниц выполните вертикальный разрез кожи и вскройте стенку брюшины.

Разрез должен быть сделан так, чтобы обнажить верхнюю часть грудины, где также разрезается грудная клетка и удаляется диафрагма. Приступайте к осторожному отодвиганию всех органов в сторону, полностью обнажая грудную аорту, расположенную вдоль позвоночника с обнаженной аортой, вставьте тонкий стерильный пинцет между аортой и позвоночником. Расправьте пинцет и постепенно приподнимайте аорту от ложа, отделяя грудной сегмент от остальной части аорты.

Теперь, когда аорта отделена, острыми ножницами отрежьте ее от мыши, начиная с конца, который находится в непосредственной близости от почечных сосудов и заканчивая рядом с сердцем. Поместите иссеченную грудную аорту в чашку Петри, наполненную холодным стерильным PBS. Теперь, когда аорта удалена, кольца аорты можно препарировать с помощью двух стерильных пинцетов и работы под биноклем.

Очистите грудную аорту от окружающей жировой ткани. Следите за тем, чтобы не повредить аорту и держите ее только по краям. Аорту следует многократно погружать в чашку Петри, содержащую PBS, чтобы предотвратить обезвоживание до тех пор, пока она не будет окончательно очищена.

Теперь, когда грудная аорта чиста, используйте хирургическое лезвие и работайте под биноклем, чтобы равномерно разрезать аорту на кольца в один миллиметр. Используя в качестве ориентира линейку, расположенную под режущей поверхностью, обязательно используйте новое лезвие и время от времени заменяйте его, чтобы сохранить остроту. Концы аорты не используются После разрезания каждого кольца с помощью пинцета очень аккуратно перенесите его в новую посуду, содержащую холодный PBS.

Поместите все кольца в одну и ту же пластину, содержащую PBS, чтобы убедиться, что анализ рандомизирован. Поскольку каждый сегмент аорты имеет несколько разный ангиогенный потенциал, держите кольца на льду. Далее подготовьте пробирную пластину с помощью предварительно охлажденных наконечников пипетки.

Добавьте в каждую лунку в 48-луночной пластине около капли 150 микролитров холодного BME, капля затвердевает до купола в середине движения. BME обеспечивает транспортировку веществ, хемотаксис клеток и, что самое важное, дифференцировку и миграцию клеток, что приводит к образованию новых сосудов. Колодцы по периметру заполняются PBS Чтобы избежать обезвоживания BME, дайте капле BME застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-30 минут. После того, как BME затвердеет, осторожно выньте аортальное кольцо из чашки Петри с помощью пинцета, чтобы предотвратить повреждение, кольцо должно быть перенесено внутрь капли липида, которая образуется между кончиками пинцета. добавьте еще 150 микролитров BME и инкубируйте от 20 до 30 минут.

При температуре 37 градусов Цельсия кольцо теперь заключено в BME и анализ. Материалы могут быть добавлены в пластину для начала анализа. Ранее приготовленная свободная среда эндотелиальной сыворотки крови человека с экспериментальным материалом или добавкой для роста эндотелиальных клеток в качестве положительного контроля для отрицательного контроля.

Используйте только носитель. Добавьте 500 микролитров среды для добавления преса в каждую лунку и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести-12 дней. В течение этого инкубационного периода исследуйте планшет под микроскопом и ищите сосуды, прорастающие из аорты, и продвинутые зрелые сосуды, выявленные дальнейшими ветвящимися сосудами.

Следует отходить от ткани кольца в трех измерениях, фотографировать кольца между 6 и 12 днем с помощью стандартного фазово-контрастного стереоскопа. Кроме того, собирайте надосадочную жидкость в разные дни между шестым и 12-м днем и храните при температуре четыре градуса для использования в течение дня или Eloqua и храните при температуре минус 20 или минус 80 для использования в будущем. Надосадочная жидкость может быть проанализирована с помощью различных методов, таких как анализ Элизы на vgf или анализ смазки на уровень оксида азота.

Эти изображения были собраны через 12 дней после установки колец в лунки и инкубации с использованием либо культуры, либо среды, видимой в верхнем ряду изображений, или ЭКГС, используемой в качестве положительного контроля наблюдаемого прорастания сосудов. На нижней панели. Каждое изображение представляет собой репрезентативный снимок четырех из 12 колец, который обычно используется при анализе для каждого состояния.

Угол каждого кольца аорты в каждой отдельной лунке черный. При таком фотографировании кольца аорты, которые подвергались воздействию ЭКГС, демонстрируют рост сосудов, а стрелки указывают на несколько из многих образовавшихся сосудов. Каждый сосуд характеризуется как цепочки эндотелиальных клеток с редким разветвлением, указывающим на то, что они зрелые.

Никаких прорастающих сосудов в культуре не наблюдается. Средние лунки на верхней панели, Мы только что показали вам, как выполнять анализ коры аорты при выполнении этой процедуры. Важно помнить о том, что нужно работать аккуратно и в их условиях.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.