Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть I: Лигнин

Определение содержания лигнина и состава клеточных стенок растений начинается с высушенного растительного материала, который подвергается различным экстракциям. Полученный материал состоит только из клеточных стенок, а затем расщепляется для определения содержания лигнина. Материал стенки подвергается гидролизу с помощью ацетилбромида, а солюбилизированные моноалы количественно оцениваются с помощью УФ-спектрометрии для определения состава лигнина.

Материал стенки гидролизуется путем цитолиза. Затем солюбилизированные компоненты лигнина получают образование их летучих производных триметилсолевого раствора, которые могут быть разделены и количественно определены с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Определение матричного полисахаридного состава и содержания целлюлозы демонстрируется в другом видео, озаглавленном «Комплексный анализ состава клеточных стенок растений, часть вторая Углеводы».

Здравствуйте, меня зовут Маркус Поли, я возглавляю аналитическую установку в Исследовательском центре биоэнергетики Великих озер в Университете штата Мичиган. Я Клифф Фостер, менеджер аналитической установки клеточных стенок. Мы покажем вам процедуру определения содержания и состава образцов растительной биомассы.

Растения преобразуют световую энергию солнца в химическую энергию, такую как биомасса. Растительная биомасса состоит в основном из клеточных стенок, сложной сети разнообразных полимеров, которые покрывают все растительные клетки. Здесь мы определяем состав материалов клеточной стенки растений, чтобы оценить потенциал преобразования лигнина Cellose X, который является широко распространенным возобновляемым ресурсом, в биотопливо.

Сегодня мы сосредоточимся на полифеноллигнине в другом видео под названием «Комплексный анализ состава клеточных стенок растений, углеводы, часть вторая». Мы сосредоточимся на анализе полисахаридов. Чтобы начать эту процедуру, добавьте три 5,5-миллиметровых шарика из нержавеющей стали в двухмиллилитровую трубку с завинчивающейся крышкой и примерно от 60 до 70 миллиграммов воздуха или сублимированного растительного материала.

Материал может быть измельчен до мелкого порошка с помощью глазковой стенки, измельчающего и дозирующего робота. Глазная стенка берет трубку и встряхивает ее в течение 30 секунд, где за счет металлических шариков материал измельчается до мелкого порошка, затем измельченный, но компактный растительный порошок разрыхляется альтернативной нероботизированной низкопроизводительной процедурой. Для облегчения ретро, представленной во второй части, добавьте 1,5 М 70%-ного водного этанола в измельченный материал вихревой материал тщательно и центрифугируйте при комнатной температуре.

Эта процедура растворяет большинство белков и клеточных органелл, аспирирует надосадочную жидкость и добавляет объем один к одному. Раствор хлороформа, метанола к нерастворимым в спирте гранулам тщательно встряхнуть, чтобы повторно раскрутить гранулу и центрифугировать. Хлороформный метанол экстрагирует гидрофобные соединения, такие как липиды, после центрифугирования, аспирирует надосадочную жидкость и ресуспендирует гранулу и 500 микролитров ацетона.

Для сушки образца выпаривают растворитель потоком воздуха при температуре 35 градусов Цельсия до полного высыхания, высушенные образцы можно хранить при комнатной температуре до дальнейшей обработки. Чтобы начать удаление крахмала из образца реуса, суспензируйте гранулу и 1,5 мил 0,1 моляра ацетата натрия рН закупорьте пробирки на пять колпачков и нагрейте их в нагревательном блоке для желатинизации крахмала. Охладив суспензию на льду, добавьте в пробирку смесь ферментов, разлагающих крахмал, и вортекс тщательно инкубируйте суспензию в течение ночи.

В шейкере при температуре 37 градусов Цельсия вращающийся шейкер обеспечивает правильное перемешивание. После ночной инкубации завершите сбраживание, нагревая в нагревательном блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, которая содержит растворенный крахмал.

Промойте оставшуюся гранулу три раза, используя 1,5 мил воды каждый раз, путем вортексирования, центрифугирования и сцеживания, как было показано ранее. Наконец, суспендируйте гранулу в 500 микролитрах ацетона и испарите растворитель потоком воздуха при температуре 35 градусов Цельсия до полного высыхания. Высушенные образцы, содержащие изолированную клеточную стенку или ножку, без целлюлозы, готовы к дальнейшему анализу и могут храниться при комнатной температуре.

Начните с взвешивания от одного до 1,5 миллиграммов подготовленного материала клеточной стенки. Материал может быть взвешен вручную или автоматическим способом с помощью глазной стенки, как показано во второй части. Промойте стенки трубки 250 микролитрами ацетона, чтобы собрать материал клеточной стенки на дне трубки, и очень осторожно испарьте ацетон под воздействием воздуха.

После того, как ацетон испарится, аккуратно добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 25% объема ацетилбромида в ледяную уксусную кислоту вдоль двух стенок. Чтобы предотвратить разбрызгивание, тонкий бромид расщепляет полимер лигнина на его ацетилированные моно. Затем закупорьте мерную колбу крышкой и нагревайте при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух часов.

Нагревайте еще час с четырьмя смс каждые 15 минут, и окончательно охладите на льду При комнатной температуре после охлаждения колбы добавьте 400 микролитров двух моляров гидроксида натрия и 70 микролитров свежеприготовленного 0,5 молярного гидроксила ламингидрохлорида вихря, в объемные колбы. Далее нейтрализуйте раствор, заполнив мерную колбу ровно до отметки в два миллилитра крышкой ледяной уксусной кислоты, и несколько раз переверните пипетку, чтобы смешать пипеткой 200 микролитров раствора, содержащего гидролизованные и солюбилизированные моноляли, в УФ-специфическую 96-луночную пластину и считайте пластину в луночном планшете ридера на 280 нанометров. Прочитайте табличку не менее трех раз и усредните впитывающую способность, так как твердые частицы могут вызвать небольшое изменение значений поглощения.

Определите процентное содержание малорастворимого бромида или А BSL с использованием соответствующего растительного коэффициента с формулой, представленной в письменном протоколе. Лигнин представляет собой полифенольную сеть, состоящую в основном из трех субъединиц: P гидроксифенола, gua ACell и пружинных единиц, что обусловлено определением состава лигнина в растительном материале. Начните с переноса примерно двух миллиграммов материала клеточной стенки в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой для цитолиза.

Далее приготовьте 2,5% трифторида бора этилом и 10% раствор этана тиола в диоксане. Поскольку диоксан очень опасен, не вынимайте никаких проб или оборудование из колпака. Не забывайте работать очень осторожно и используйте баллон, наполненный газообразным азотом, чтобы вытеснить потерянный объем в бутылке с диоксаном азотом.

Приготовьте раствор, смешав следующие объемы на пробу: 175 микролитров диоксана, 20 микролитров ЭТШ, пять микролитров, БФ три. После перемешивания добавьте по 200 микролитров раствора в каждый образец. Продуйте верхнее пространство флакона газообразным азотом и крышкой.

Немедленно приступайте к нагреву образцов до 100 градусов Цельсия в течение четырех часов с аккуратным перемешиванием каждый час. Тео ас лизиса реакция на льду в течение пяти минут. Затем добавьте 150 микролитров 0,4 моляра гидрокарбоната натрия для нейтрализации и завихрения.

Для очистки продуктов распада лигнина добавьте один мил воды и 0,5 мил ацетатного вихря и дайте фазам разделиться. Слой этилацетата будет сверху, а вода внизу. Перелейте 150 микролитров верхнего слоя ацетата Ethel, содержащего компоненты лигнина, в двухмиловую пробирку, следя за тем, чтобы вода не переносилась.

После переноса с верхнего слоя ацетата Ethel испарить растворитель с помощью концентратора с воздухом. Добавьте 200 микролитров ацетона и выпарите. Повторите обработку ацетоном два раза, чтобы удалить лишнюю воду.

Далее для получения компонентов лигнина из их летучих производных триметила Cy Lane. Добавьте в каждую пробирку 500 микролитров этилацетата, 20 микролитров пурина и 100 микролитров триметилцилацетамида NO biss. Выдерживать в течение двух часов при температуре 25 градусов Цельсия.

По истечении двух часов перелейте 100 микролитров реакции во флакон с ГХ МС и добавьте 100 микролитров ацетона. Анализируйте образцы с помощью ГХ, оснащенного четырехкратным масс-спектрометром или пламенно-ионизационным детектором. Колонку и детали пробега можно найти в прилагаемом письменном протоколе.

Вот некоторые репрезентативные результаты анализа лигнина с использованием древесины тополя в качестве растительного материала. Согласно этому анализу, 22% материала тополя состоит из полифеноллигнина. Состав компонентов лигнина был проанализирован с помощью ГКМЦ.

Пики идентифицируются по относительному времени удержания с использованием внутреннего стандарта тетракоана или по характерным значкам масс-спектра, равным 2 99 MZ, 2 69 MZ и 2 39 MZ для мономеров sg и h соответственно. Состав компонентов лигнина количественно определяется путем установки общей площади пика равной 100%Анализ состава показывает, что этот конкретный образец содержит в основном строки или S-единицы. Тем не менее, единицы Goya, aol или G также в изобилии.

Очевидно, что количество и состав монолиальных единиц могут варьироваться в зависимости от ткани и вида растения. Мы только что показали вам, как определить содержание лигнина и состав растительного сырья для анализа на полисахариды. Переходим к части второй.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.