Объединение рамановских изображений и многофакторного анализа для визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в стенке клетки растения

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы представить общий метод визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в клеточной стенке растений с помощью рамановской визуализации и многомерного анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомассы растений, например, как основные химические компоненты распределяются в клеточной стенке растения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно получить нетрудоемкую и неразрушающую информацию о образце при минимальной подготовке образца.

Для начала вырежьте небольшой тканевый блок из образца растения. Погрузите салфетку в кипящую деионизированную воду на 30 минут. Затем сразу же переложите его в деионизированную воду комнатной температуры на 30 минут.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока салфетка не опустится на дно контейнера, указывая на то, что воздух в салфетке был удален и что ткань размягчилась. Приготовьте 20%50%70% и 90%аликвоты ПЭГ и деионизированной воды, а также чистый ПЭГ. Держите растворы на уровне 65 градусов по Цельсию.

Инкубируйте ткань в серии градуированных ванн с ПЭГ, чтобы вытеснить воду и позволить ПЭГ проникнуть. Высушите в 20% PEG в течение одного часа, 50% PEG в течение полутора часов, 70% PEG в течение двух часов, 90% PEG в течение двух часов и 100% PEG в течение 10 часов. Далее предварительно прогрейте кассету при температуре 65 градусов Цельсия в духовке.

Залейте тканевый блок, содержащий ПЭГ, в кассету, а затем поместите тканевый блок в нужное положение с помощью предварительно нагретого пинцета или игл. Медленно охладите кассету и храните салфетку при комнатной температуре до использования. Рассеките блок ПЭГ, содержащий целевую ткань, на небольшой блок с помощью острого лезвия бритвы.

Установите небольшой блок PEG на микротом и вырежьте тонкие участки из блока PEG. Затем промойте срезы деионизированной водой в часовом классе 10 раз, чтобы удалить ПЭГ из ткани. Затем погрузите срезы с толуолом и этанолом на шесть часов, чтобы удалить экстрактивные вещества.

Приготовьте реакционную жидкость, смешав в стакане 65 мл деионизированной воды, 0,5 мл уксусной кислоты и 0,6 г хлорида натрия. Добавьте одну секцию и 3 мл реакционной жидкости во флакон объемом 5 мл. Закрутите верхнюю часть флакона.

Затем нагрейте флакон на водяной бане при температуре 75 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы удалить лигнин из ткани. Промойте секцию деионизированной водой в стекле часов 10 раз. Далее перенесите необработанный и одревесневший срез на предметное стекло микроскопа.

Аккуратно разверните срез с помощью кистей или иголок. Удалите лишнюю деионизированную воду с помощью папиросной бумаги. Затем погрузите секцию в оксид дейтерия.

Накройте образец стеклянной крышкой. Заклейте крышку лаком для ногтей, чтобы предотвратить испарение оксида дейтерия. Откройте программное обеспечение конфокального рамановского микроскопа.

Включите лазер и сосредоточьтесь на обслуживании кристалла и кремния с объективом 100-кратного микроскопа. Нажмите кнопку калибровки для калибровки прибора. Переключите прибор в режим оптического микроскопа и включите лампу микроскопа.

Установите предметное стекло микроскопа на предметное стекло так, чтобы защитное стекло было обращено к объективу. Просмотрите образец с помощью объектива 20-кратного микроскопа и найдите интересующую область. Переключитесь на объектив иммерсионного микроскопа.

Нанесите иммерсионное масло на покровное стекло, затем сосредоточьтесь на поверхности образца. Далее переключите прибор в режим комбинационного тестирования и выключите лампу микроскопа. Выберите область сопоставления с помощью прямоугольного инструмента.

Измените размер шага, чтобы определить количество полученных спектров. Имейте в виду, что размер шага должен быть больше диаметра пятна, рассчитанного по числовой апертуре объектива. Размеры ниже этого значения приведут к избыточной выборке.

Установите оптимальные спектральные параметры для получения наилучшего отношения сигнал/шум и спектрального качества, а также соответствующего времени сбора данных в зависимости от пригодности образца. Как правило, параметры визуализации вводятся в программное обеспечение прибора с использованием лазерной длины волны 532 нанометра, фильтра 100% отверстия 300, щели 100, спектрометра 1840 обратных сантиметров, канавок 1200T, 60-кратного масляного объектива и времени сбора данных двух секунд. Сохраните спектральные данные перед обработкой данных и преобразуйте их в универсальный формат, прежде чем приступать к анализу данных, как описано в текстовом протоколе.

Здесь показаны исходные спектры комбинационного рассеяния света стенки тополиной ячейки. Два основных шумовых сигнала, включая дрейф базовой линии и космические всплески, распространяются в каналы вместе с фактическими сигналами. Они должны быть удалены перед анализом данных.

Для устранения этих шумовых сигналов может быть применен метод шумоподавления, такой как алгоритм Савицкого-Голе или вейвлет-алгоритм. Для визуализации лигнина рассмотрим спектральный пик около 1600 обратных сантиметров из-за симметричной растягивающей вибрации ароматического кольца. Для визуализации полисахаридов используйте спектральный пик около 2889 обратных сантиметров из-за растяжек CH и CH2.

Однако рамановские изображения целлюлозы и гемицеллюлозы не могут быть сгенерированы напрямую. Делигнификация является необходимой процедурой для выявления их спектральных характеристик. Вообще, мы новички в этом методе.

Мы испытываем трудности, потому что это требует обучения работе и внешнему виду срезов образцов и анализу данных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить химическую информацию о клеточной стенке растения с помощью методов in-situ. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как предварительная химическая обработка, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как стойкость клеточной стенки растения.

Хотя этот метод может дать представление о внутренней структурной природе и топохимии внутри клеточной стенки растения, он также может быть применен к другим биологическим образцам.