Обратный генетический подход для тестирования функциональной избыточностью во время эмбриогенеза

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить, являются ли два гена функционально избыточными для спецификации определенной клеточной линии. Это достигается путем определения потери функционального фенотипа каждого отдельного гена с использованием ген-специфичных морфозов, вводимых в развивающиеся эмбрионы рыбок данио. Вторым этапом процедуры является разработка анализа для количественной оценки спецификации или дифференцировки клеточной линии.

Например, с помощью репортерного сорта рыбы, как мы покажем здесь. Третьим этапом процедуры является объединение двух морфных FENO для одновременной коррекции потери функции обоих генов. Заключительным этапом процедуры является оценка фенотипа, вызванного двойным нокдауном.

В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают потерю или усиление функции клеток определенной линии путем изучения репортера линии или анализа экспрессии маркера, специфичного для линии. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как объединение нокаутов в мышиной модели, заключается в том, что два или даже три гена могут быть нацелены на рыбью модель, просто объединив проверенные морфы в одном эксперименте. Более 100 эмбрионов могут быть введены и оценены фенотипы в течение нескольких дней.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы. В биологии развития, такой как определение транскрипционных путей, которые контролируют судьбу клеток, ключевые регуляторные пути часто представлены небольшими семействами родственных генов, которые являются функционально избыточными. Таким образом, их роль не очевидна в исследованиях нокаута мышей из-за компенсации сестринских генов.

Хотя эта модель может дать представление об эмбриогенезе рыбок данио, результаты могут быть применены к другим системам, таким как мыши, поскольку одни и те же генетические программы обычно хорошо сохраняются на протяжении всей эволюции. Подготовьте микроинъекционные пластины перед введением эмбрионов. Налейте примерно 12 миллилитров 2%agros в воду системы, то есть чистую воду, взятую непосредственно из системы аквариума в перевернутую крышку 100-миллиметровой чашки Петри.

Упрьте два предметных стекла микроскопа под углом примерно 45 градусов в обе стороны крышки. Когда агрос застынет, аккуратно оттягиваем предметные стекла от крышки, создавая корыта, где эмбрионы будут отдыхать во время инъекции морфа, для которых не выдерживают стебли при комнатной температуре в концентрации одного миллимольяра и стерильно дистиллируют деионизированной водой перед введением. Инкубируйте запасы морфоса при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы убедиться, что они полностью растворены.

Дайте запасам остыть до комнатной температуры. Каждый вновь разработанный морфо должен быть эмпирически проверен на активность и толерантность эмбриона. В микроцентрифужных пробирках начните с одного-двух последовательных разбавлений исходного морфо в дистиллированной деионизированной воде с получением рабочих концентраций один миллимоляр, 0,5 миллимоляра, 0,25 миллимоляра и 0,125 миллимоляра.

Под зондом для препарирования используйте всасывание для фронтальной загрузки калиброванной инъекционной иглы, которая была прикреплена к микроманипулятору и правильно расположена. Загрузите в иглу примерно один микролитр раствора морфо с самой низкой концентрацией. С помощью трансферной пипетки переместите оплодотворенные одноклеточные эмбрионы в борозды пластины для микроинъекций.

С помощью пипетки удалите лишнюю воду из тарелки, чтобы эмбрионы упали на дно кормушки. Расположите инъекционную пластину под микроскопом, опустите иглу через корион внутрь желтка. Вводите каждый эмбрион перед удалением иглы и изменением положения инъекционной пластины, чтобы получить доступ к следующему эмбриону.

При обучении инъекции может быть полезно использовать жизненно важный краситель для визуализации инъекции в клетку, как показано здесь, перенести эмбрионы обратно в 100-миллиметровую чашку Петри с системой воды, культивировать их при температуре 28,5 градусов Цельсия. Изгоните оставшийся раствор морфо из иглы и заполните его морфо следующей по самой высокой концентрации для введения следующей партии эмбрионов на соответствующей стадии развития. Исследуйте эмбрионы на фенотипы при каждой введенной концентрации морфо.

Пороговая доза для каждого морфо — это самая низкая доза, при которой существует определенный надежный фенотип. Для определения неточного порога может потребоваться несколько раундов титрования. Искать генетическое взаимодействие между двумя различными генами.

Приготовьте смесь из двух интересующих морфо, каждая из которых имеет соответствующую пороговую концентрацию. Важно иметь в виду, что эмбрионы могут не переносить более 20 нанограммов общего морфо за одну инъекцию. Вводите эмбрионы таким же образом, как и раньше.

Поддерживайте постоянные объемы инъекций между экспериментальной и контрольной группами, которые должны включать наборы, вводимые с каждым морфо отдельно под препарирующим микроскопом. Наблюдайте за введенными эмбрионами сразу после инъекции и несколько раз в течение дня используйте пипетку для переноса для удаления любых мертвых или умирающих эмбрионов. Поскольку они могут поставить под угрозу жизнеспособность оставшихся морфинов с помощью пипетки для переноса, эмбрионы перемещаются, усыпляются или усыпляются в любое время.

Наведите указатель на предметное стекло для наблюдения. Для фотосъемки. При необходимости используйте острые щипцы для удаления кориона.

Стабилизируйте эмбрион в капле 3%Метилцеллюлоза для скрининга эмбрионов на наличие отчетливого фенотипа, уникального для комбинации морфо, в отличие от большей пенетрантности фенотипа одиночных морфинов. Вот несколько эмбрионов дикого типа при введении морфоса на пороге. Для пятой гаты типичным фенотипом является cardio bifida или два сердца, потому что прародители не смогли слиться по средней линии.

Обратите внимание на GFP-положительные кардиомиоциты, обозначенные стрелками. Фенотип шести морфинов включает в себя сердца с неправильной формой, которые не могут зацикливаться должным образом. У этих эмбрионов также развиваются GFP-положительные кардиомиоциты.

Тем не менее, эмбрионы были введены с комбинацией морфов gata five и gata six, показанных здесь. Демонстрируют полную потерю развития кардиомиоцитов, указывающую на то, что для развития кардиомиоцитов должна быть экспрессирована либо gata five, либо gata six. Эти два гена функционально избыточны для спецификации кардиомиоцитов.

При попытке выполнить эту процедуру, важно сначала полностью проверить свои морфы и быть как можно более уверенными, что они представляют собой истинный нокдаун одного гена-мишени после этой процедуры. Другие методы, такие как объединение условных нулевых аллелей мыши, могут быть применены для того, чтобы показать, что функционируют одни и те же гены. То же самое и у млекопитающих.

После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить, являются ли два гена функционально избыточными во время эмбриогенеза.