Реверс Генетическая Морфолино подход с использованием Сердечная желудочка Injection для трансфекции нескольких трудных для тканей-мишеней в данио рерио Личинка

Общая цель данной процедуры заключается в доставке морфолино-олигонуклеотидов путем вентрикулярных инъекций личинкам рыб Danio rerio для нокдауна генов с целью оценки их функции в процессе регенерации. Это достигается путем предварительного обезболивания личинок и их размещения в пазу форма для фиксации. Затем инъекционная игла вводится в желудочек сердца.

Затем раствор morpho вводят в желудочек от четырех до шести раз с интервалами между импульсами для обеспечения очистки сердца. В завершение проводят ампутацию плавника, оставляя его регенерировать в течение трех дней. В итоге влияние на регенерацию плавника оценивают путем измерения площади регенерированной части плавника с помощью инструмента line tracing в программном обеспечении с открытым исходным кодом Fiji ImageJ.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как трансгенез или мутагенез, является возможность нокдауна генов с помощью морфолино в тканях личинок, которые не подходят для прямых инъекций. Используя стеклянные капилляры диаметром 0,75 мм, поместите один из них в вытягиватель игл и вытяните иглу со следующими параметрами; затем с помощью часового пинцета и под стереомикроскопом с микрометрическим окуляром обломите вытянутый капилляр, чтобы получить иглу диаметром 20 мкм. После этого используйте токарный станок с закрепленным резиновым вращающимся колесом, чтобы заточить иглу и создать скос размером 20 мкм. Подготовьте стоковый раствор морфолино, растворив лиофилизированный Morpho в 1XPBS до конечной концентрации 7,5 мМ.

Приготовьте раствор для инъекции Morpho, смешав 2,5 µL исходного раствора Morpho с 2,8 µL 1 мM исходного раствора endo Porter, чтобы получить конечную концентрацию 3,5 мM morph и 0,5 мM endo porter для проведения инъекций. С помощью микропипетки с наконечником на 10 µL наберите в скошенную стеклянную иглу 5 µL раствора morpho. Затем вставьте стеклянную иглу в держатель иглы микроманипулятора, подключенного к пневматическому пико-насосу.

Отрегулируйте угол введения таким образом, чтобы он составлял примерно 45 градусов; это позволит перемещать иглу только в одной плоскости. Затем установите следующие значения микроинъектора: давление удержания (hold pressure) 20 pounds per square inch или PSI, давление выброса (ejection pressure) 15 PSIA, интервал гейтирования 100 millisecond и значение периода 1.9, что соответствует 10.9 milliseconds. Приготовьте 20 milliliters расплавленного 1.5% agarose в 1X PBS и разлейте его в 10 centimeter чашку Петри.

Затем поместите рифленую форму для инъекций в теплый агар, чтобы создать в затвердевшем геле бороздки для анестезии личинок. Поместите их в 100 миллилитров аквариумной воды с добавлением 20 миллиграммов на литр трикаина. После того как личинки перестанут реагировать на прикосновение, с помощью пластической пастуральной пипетки осторожно перенесите личинку в бороздку влажной агаровой формы так, чтобы вентральная сторона была обращена к вертикальной стенке бороздки.

Поместите планшет aros под стереомикроскоп так, чтобы желудочек был направлен в сторону от иглы для инъекций. Затем опустите иглу и введите ее примерно на одну-две микрометра в желудочек сердца. Будьте осторожны, чтобы не ввести иглу слишком глубоко.

Затем введите однокрасную дозу 3 нл раствора морфолино в желудочек и подождите, пока сердце очистится, после чего повторите процедуру, введя еще пять таких доз; извлеките иглу и поместите ее в чашку Петри с 1 XPBS, чтобы предотвратить высыхание. Затем с помощью переносной пипетки, заполненной средой E3, осторожно перенесите личинок обратно в чашку Петри со свежей средой E3, чтобы обеспечить поглощение и удержание морфолино в клетках. Повторяйте инъекции каждые 12–24 часа на протяжении всего эксперимента для оценки эффективности введения.

После анестезии поместите рыб на плоскую влажную чашку Ароса с среде E3, затем с помощью стереомикроскопа в режиме светлого поля и флуоресценции получите их изображения. Для анализа регенерации используйте бесплатное программное обеспечение Fiji Image J, применяя инструмент трассировки линий (line tracing tool) для определения степени регенеративного роста. Сначала откалибруйте изображения, перетащив файл в главное окно Fiji через главное меню.

Установите масштаб для всех изображений, выбрав пункт analyze в выпадающем меню. Нажмите set scale, затем активируйте глобальную опцию, установив соответствующий флажок. Теперь снова перетащите изображение, чтобы измерить объем регенерационного роста с помощью панели инструментов.

Выберите инструмент произвольного выделения и обведите область, которую необходимо измерить. Затем нажмите Ctrl M. Это откроет новое окно результатов, в котором будет указано значение площади обведенной области в квадратных пикселях. Как видно здесь, спустя несколько минут после инъекции, раствор morpho endo porter распределяется по сосудам в различные ткани, такие как плавниковая складка и головной мозг, и сохраняется там в течение 12 или более часов.

Для оценки регенерации дистальных структур плавника личинки были удалены следующие элементы: дистальный кончик плавниковой складки и спинной мозг, дистальный хордальный отдел, дистальная мускулатура туловища (не видна здесь) и пигментные клетки, которые трудно подвергнуть прямому введению, но которые, по всей видимости, поглощают морфолино после серийных вентрикулярных инъекций. Таким образом, данный метод относительно легко способствует доставке морфолино в ткани, которые трудно воздействовать индивидуально, и позволяет одновременно оценивать функцию генов в нескольких тканях регенерирующего плавника. Для анализа значимости конкретных генов, участвующих в регенерации, плавник личинки подвергается частичной ампутации, после чего все ткани, поглотившие морфолино, иссекаются.

Как было продемонстрировано, плавничный сгиб личинки восстанавливает свою структуру в течение нескольких дней после ампутации. В данном случае использование морфолино, нацеленных на гены, необходимые для регенерации, нарушило регенерационный ответ по сравнению с контрольными группами без инъекций и с использованием неспецифичных морфолино после их введения. Этот метод открыл исследователям в области регенерации путь к изучению молекулярных механизмов, участвующих в регенерации плавника Danio rerio.