Реверс Генетическая Морфолино подход с использованием Сердечная желудочка Injection для трансфекции нескольких трудных для тканей-мишеней в данио рерио Личинка

Общая цель этой процедуры заключается в доставке морф-эно-олигонуклеотидов через желудочковые инъекции в личинку, лагерный плавник и гены нокдауна для оценки их функции во время регенерации. Это достигается путем предварительного обезболивания личинок и помещения их в канавку формы для ароса. Далее инъекционная игла вводится в сердечный желудочек.

Затем раствор морфо вводится от четырех до шести раз в желудочек с интервалами между импульсами, чтобы обеспечить очищение сердца. Наконец, ласковый плавник ампутируют и дают ему восстановиться в течение трех дней. В конечном счете, влияние на регенерацию плавника можно затем оценить, измерив регенерированную площадь плавника с помощью инструмента трассировки линий программного обеспечения Fiji image J с открытым исходным кодом.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как трансгенез или мутагенез, заключается в том, что она позволяет сбить минозаврами гены в личиночных тканях, которые не подходят для прямых инъекций. И под стереоскопом с окуляром микрометра разломать вытянутый капилляр, чтобы получилась игла диаметром 20 микрометров. Затем с помощью токарного станка со сцепленным резиновым прялкой заточить иглу и произвести скос 20 микрометров. Приготовьте морфо-бульон, растворив лиофилизированный морфо в одном XPBS до конечной концентрации 7,5 миллимоляра.

Смешайте раствор для инъекций Morpho, соединив 2,5 микролитра стокового раствора Morpho с 2,8 микролитрами одного миллимолярного стокового раствора эндо Портера для конечной концентрации 3,5 миллимоляра морфа и 0,5 миллимолярного эндопортера для проведения инъекций. С помощью микропипетки с наконечником объемом 10 микролитров загрузите в скошенную стеклянную иглу пять микролитров раствора морфо. Затем вставьте стеклянную иглу в иглодержатель микроманипулятора, подключенного к пневматическому насосу пико.

Отрегулируйте угол для инъекций примерно до 45 градусов, чтобы иглу нужно было перемещать только в одном направлении рубанка. Затем установите следующие значения микроинжектора: давление удержания 20 фунтов на квадратный дюйм или давление PSI, давление выброса 15 фунтов на квадратный дюйм, диапазон стробирования 100 миллисекунд и значение периода 1,9, что соответствует 10,9 миллисекундам. Приготовьте 20 миллилитров растопленного 1,5% ароса в одном XPBS и вылейте его в 10-сантиметровую чашку Петри.

Затем поместите рифленую форму для литья под давлением в теплые отверстия, чтобы в затвердевшем геле образовались борозды для обезболивания личинок. Поместите их в 100 миллилитров аквариумной воды с 20 миллиграммами на литр трикана. После того, как они перестанут реагировать на прикосновение, с помощью пластиковой пасторальной пипетки осторожно перенесите личинку в углубление влажной формы ароса так, чтобы подфюзеляжная сторона была обращена к вертикальной стенке канавки.

Поместите пластину aros под стереомикроскоп так, чтобы желудочек был обращен в сторону от иглы для инъекции. Далее опустите иглу и введите ее примерно на один-два микрометра в желудочек сердца. Будьте осторожны, чтобы не вставлять его слишком глубоко.

Затем введите три нанолитра импульса раствора Morpho в желудочек и вес, чтобы обеспечить очищение сердца, прежде чем повторить еще пять импульсов после инъекции, извлеките иглу и поместите ее в чашку Петри, содержащую один XPBS, чтобы предотвратить высыхание. Затем с помощью передаточной пипетки, наполненной средой Етри, осторожно перенесите личинки обратно в чашку Петри, содержащую свежую среду Етри, чтобы обеспечить поглощение и поддержание морфо в клетках. Повторяйте инъекции каждые 12–24 часа в течение всего эксперимента, чтобы оценить инъекции.

После обезболивания рыб поместите их на плоскую влажную пластину, покрытую средой E three, а затем используйте стереомикроскоп с ярким полем и флуоресценцией для их изображения. Анализируйте изображения для регенерации с помощью бесплатного программного обеспечения Fiji Image J, чтобы использовать инструмент трассировки линий для определения количества произошедшего регенеративного роста. Сначала откалибруйте изображения, перетащив файл в главное окно Фиджи в главном меню.

Установите масштаб для всех изображений, нажав на «Анализировать» в выпадающем меню. Нажмите «Установить масштаб», затем включите глобальный параметр, установив флажок. Теперь снова перетащите изображение, чтобы измерить величину регенеративного роста на панели инструментов.

Выберите инструмент «Выделение от руки» и обведите область, которую нужно измерить. Наконец, нажмите Ctrl M. Откроется новое окно результатов, показывающее значение обведенной области в квадратных пикселях. Как видно на рисунке, в течение нескольких минут после инъекции раствор morpho endo porter распределяется по всей сосудистой сети в различные ткани, такие как складка плавника и мозг, в течение как минимум 12 или более часов.

Для оценки регенерации дистальных структур личиночного плавника были удалены: дистальный кончик плавниковой складки и спинной мозг, дистальный отдел нулевого канатного мозга, дистальная мышца туловища, которая здесь не видна, и пигментные клетки, на которые трудно нацелиться путем прямого введения, но, по-видимому, они включают морфозу после серийных желудочковых инъекций. Таким образом, этот метод относительно легко способствует доставке морфо в ткани, которые трудно индивидуально нацелить, и позволяет оценить функцию генов в нескольких тканях в регенерирующем плавнике одновременно. Чтобы проанализировать важность специфических генов, участвующих в регенерации, плавник личинки частично ампутируют, и все ткани, которые включали в себя морфо, резецируют.

Личиночная плавниковая складка восстанавливает свою структуру в течение нескольких дней после ампутации, как показано на рисунке. В данном случае морфо нацелен на гены, необходимые для регенерации, нарушая реакцию регенерации по сравнению с инъекционным и несоответствующим контролем морфо контроля после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области регенерации к изучению молекулярных механизмов, которые участвуют в регенерации плавника рыбки данио