Структурно-функциональные исследования в мышиных эмбриональных стволовых клеток Использование Рекомбиназа-опосредованного кассетный Обмен

Общая цель этого структурно-функционального метода состоит в том, чтобы проанализировать на молекулярном уровне роль различных белковых доменов или мутаций, связанных с заболеванием, в наивных или дифференцированных эмбриональных стволовых клетках мышей. Этот метод может помочь выяснить, как различные остатки или домены белка могут способствовать его функционированию в данном клеточном контексте. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет очень эффективно нацеливаться на спасательные конструкции в геноме нокаутированных эмбриональных стволовых клеток, или ES-клеток, и исследовать их роль в различных типах клеток.

Для этого мы объединили три высокоэффективные технологии. К ним относятся улучшенная изоляция эмбриональных стволовых клеток мыши, сборка фактора нацеливания на основе рекомбинации и нацеливание на ES-клетки с помощью рекомбинационно-опосредованного кассетного обмена, или RMC. Некоторые из процедур будет демонстрировать Джинке Д'Хонт, техник из моей лаборатории.

Рекомбинационно-опосредованный кассетный обмен, или RMCE, позволяет осуществлять обмен фрагментами ДНК между вектором и геномным локусом. RMCE использует гетероспецифические сайты рекомбинации, которые не вступают в перекрестную реакцию и встроены в геномный локус. В присутствии донорской плазмиды, содержащей фрагмент ДНК, фланкированный теми же гетероспецифическими сайтами, рекомбиназа будет вставлять этот фрагмент ДНК в RMCE-совместимый геномный локус из-за двойной одновременной транслокации.

Только после правильной рекомбинации захваченный ген устойчивости к неомицину без промотора в стыковочном сайте Rosa 26 будет восстановлен с помощью промотора PGK во входящем векторе нацеливания, что приводит к лекарственной устойчивости. Эта система ловушек устойчивости к неомицину обеспечивает очень высокую эффективность нацеливания, часто близкую к 100%За день до выделения бластоцисты добавьте 0,1% желатина в 12 хорошо культивируемых планшетов. И инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Отсадите желатиновый раствор. Затем посадите одну четверть флакона P2 Mouse Embryonic Fibroblasts, или MEFs, в среду MEF и разделите на 12-луночный планшет. Инкубируйте 12-луночные планшеты MEF в двух миллилитрах среды MEF при температуре 37 градусов Цельсия.

И вырастите клетки до сливающегося монослоя. Затем добавьте в лунки 10 микрограмм на миллилитр семян митомицина. И инкубируйте культуры в течение трех часов при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать клетки.

После отбора гетерозиготных нокаутных мышей, содержащих кассету RMCE в локусе Rosa 26 в соответствии с текстовым протоколом, были организованы скрещивания для скрещивания RMCE-совместимых гетерозиготных нокаутных мышей, с гетерозиготными нокаутными мышами. На следующее утро проверьте наличие пробок для совокупления, подняв самку за основание сказки, и осмотрите вход во влагалище на предмет белесой массы. Если пробку плохо видно, с помощью наклонного щупа слегка раздвиньте губы вульвы, затем отделите закупоренных самок от их самцов.

Собрать бластоцисты через 3,5 дня после коитуса, или ДПК. После усыпления беременных самок сделайте средний вентральный разрез и с помощью тонких ножниц и щипцов рассеките матку и яйцевод. Затем согните иглу 26-го калибра под углом 45 градусов, прикрепленную к шприцу объемом 1 миллилитров, наполненному средой M2.

И ввести иглу в тот конец матки, который находится ближе всего к яйцеводу. Используйте тонкие щипцы, чтобы удерживать иглу на месте, одновременно нажимая на поршень, чтобы смыть бластоцисты из матки в крышку 10-сантиметровой посуды. Матка будет набухать, если промывка пройдет успешно.

С помощью ротовой пипетки соберите все эмбрионы в каплю среды М2 и дважды промойте эмбрионы в капле среды М2. Сразу после промывания эмбрионов используйте PBS, чтобы дважды промыть инактивированные клетки митомицина-С. Затем с помощью ротовой пипетки поместите каждую бластоцисту в отдельную лунку обработанных митомицином-С MEF в клеточной среде SRES, дополненных плюрипотентом или 2I.

Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Обновляйте клеточную среду SREF каждые два-три дня. Исследуйте каждую бластоцисту под стереомикроскопом при 4-кратном увеличении и проверьте наличие вылупления и отслоения от слоя MEF.

Через 10-12 дней посева под стереомикроскопом используйте пипетку P10 с одноразовыми наконечниками, чтобы отобрать отдельные выросты циума. Перенесите каждый выросток примерно в 10 микролитров среды в V-образный 96-луночный планшет, содержащий 30 микролитров PBS на лунку. С помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую лунку по 50 микролитров 0,25%-ного трипсина.

И инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех минут. Добавьте 100 микролитров предварительно инкубированной FPS-содержащей ES-клеточной среды и диссоциируйте выросты циуса на отдельные клетки путем пипетирования от 10 до 15 раз. Затем диссоциированные клетки переносят на митомицин-С, обработанные 96 луночными MEF-планшетами.

На следующий день смените носитель на основе SR. Расширяйте ЭС-ячейки аналогичным образом с 24 до 6-луночных планшетов. После идентификации спасенных векторов КДНК в соответствии с текстовым протоколом приготовьте реакцию LR объемом 10 микролитров с использованием 100 нанограммов вектора спасательной КДНК, 150 нанограммов предварительно иссеченного вектора RMCEDV1 и двух микролитров смеси рекомбиназы, содержащей кодируемую фагом интегразу, эксцизионазу и фактор бактериальной интеграции хозяина.

Инкубируйте реакцию при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух часов. Чтобы преобразовать рекомбинированные векторы, добавьте по 5 микролитров каждой смеси, к 40 микролитрам термошоковой компетентной бактерии E.Coli, в 2-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой. И инкубируйте образец на льду в течение 20 минут.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Добавьте в пробирку один миллилитр среды LB и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Тарелка 50 микролитров на агаровых пластинах с ампициллином.

И вырасти до 37 градусов по Цельсию за ночь. Определите колонии с правильным вектором наведения, используя подсказку P200, чтобы случайным образом выбрать пять колоний. Перенесите наконечник в стеклянную пробирку, содержащую от двух до пяти миллилитров LB среды, и выращивайте в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.

После извлечения ДНК из каждой колонии проверьте образцы, расщепляя от 0,5 до двух микрограммов ДНК, и разделите образцы на 1%-ном агарозном геле. Начните культивировать совместимые RMCE-совместимые нокаутирующие ES-клетки и пропустите их не менее двух раз на MEF в среду ES-клеток на основе FBS. Затем расщепляют ЭС клетки на желатинизированной шестилуночной пластине.

На следующий день используйте 1,5 миллилитра среды для ES-клеток на основе FBS, чтобы освежить ES-клетки, которые конфлюентны примерно на 50%. Соедините один микрограмм предварительно иссеченного вектора нацеливания RMCEDV1, содержащего спасательную CDNA, и один микрограмм экспрессии плазмиды FLIPe в 250 микролитрах чистой среды DMEM. Добавьте семь микролитров трансвекционного реагента на основе липофектина к 250 микролитрам чистой среды DMEM.

И инкубируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре. Объедините растворы ДНК и липофектина. И выдержать смесь при комнатной температуре в течение 20 минут.

Затем пипеткой нанесите трансвекционную смесь на обновленные ES-клетки и аккуратно взболтайте. Через день после трансвекции разделите все ES-клетки из пробирки в 10-сантиметровую чашку для культур с сливающимся слоем DR4 MEFS и 10 миллилитрами клеточной среды ES на основе FPS. Через два дня после трансвекции выберите клоны ES-клеток с правильным FLIP-e опосредованным заменой кассет, добавив в среду G418.

Как показано на рисунке, массовое уничтожение нецелевых колоний должно быть видно через три-пять дней. Колонии должны появиться через семь-10 дней. Выберите эти колонии, затем расширьте их и проверьте клоны, как показано ранее в этом видео.

Для дифференцировки ЭС-клеток в эмбриоидные тельца, или БЭ, после культивирования нокаутирующих ЭС-клеток с помощью спасательных конструкций, управляемых Rosa 26, в соответствии с текстовым протоколом, позволяют БЭ формироваться в неадгезивных чашках в течение 30 дней. Обновляйте среду каждые два-три дня, перекладывая суспензию EB в тюбик объемом 50 миллилитров. И пусть ЭБ оседают под действием силы тяжести.

Удалите надосадочную жидкость, добавьте свежую среду и переложите суспензию EB в посуду бактериального класса. Анализируйте ЭС-клетки и БЭ методом иммунофлюоресценции и ПЭМ, согласно текстовому протоколу. С использованием метода структурной функции были сгенерированы пять предварительно иссеченных RMCEDV1 векторов нацеливания с эффективностью 100%, и эти спасательные конструкции были нацелены через RMCE, чтобы катенин P120 нокаутировал ES-клетки, с эффективностью 97%. Морфология кистозного БЭ может быть использована в качестве фенотипического считывания для скрининга различных спасательных конструкций.

В качестве доказательства концепции, управляемая R26 изоформа катенина P120 1A спасла фенотип нокаута p120. Чтобы проверить, способствует ли независимое от E-кадгерина закрепление катенина P120 образованию csytic EB, мотив нацеливания на мембрану k-ras, CAAX, был слит с карбокси-концом катенина P120 и введен через RMCE в клетки нокатенина P120, прежде чем из них были созданы EB. Однако эта конструкция служит доминирующим негативом, который не позволяет связываться и стабилизировать Е-кадгерин.

И, как следствие, не спасает фенотип нокатена p120. Эпителиально-мезенхимальный переход, или ЭМП, является важным процессом развития, который также происходит во время дифференцировки ЭС-клеток. При экспрессии в р120 катенина нокаутирующие ЭС клетки, индукторы ЭМП, ZEB1, ZEB2 или улитки, которые могут напрямую подавлять различные гены эпителиальных маркеров, такие как Е-кадгерин, не смогли восстановить образование кистозных БЭ.

После освоения RMCE-совместимые ES-клетки могут быть изолированы в течение одного месяца. RMCE-совместимые векторы нацеливания могут быть сгенерированы в течение одной недели, а целенаправленное спасение ES-клеток может быть достигнуто в течение одного месяца с помощью этого метода, если оно выполнено правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать RMCE для проведения исследований структурных функций наивных или дифференцированных эмбриональных стволовых клеток.