PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

Общей целью этой процедуры является определение сайтов связывания РНК-связывающих белков или RVP в широком транскриптоме. Это достигается за счет использования фотореактивных аналогов нуклеозидов для мечения in vivo зарождающихся транскриптов. Вторым этапом процедуры является сшивание РНК и РНК-связывающих белков с помощью ультрафиолетового излучения с яркостью 365 нанометров.

Третьим этапом процедуры является иммуноосаждение исследуемого РНК-связывающего белка и восстановление поперечной связи с РНК. Заключительным этапом процедуры является преобразование РНК в библиотеку CD NA и глубокую последовательность. В конечном итоге могут быть получены результаты, которые показывают сайты связывания RVP в широком транскриптоме и позволяют определить элемент узнавания РНК и его предпочтения по связыванию.

Здравствуйте, меня зовут Маркус Хоффнер из лаборатории Тома Села в Рокфеллеровском университете в Нью-Йорке. Сегодня мы покажем метод, называемый par lip или фотоаналоговый аналог нуклеозида ребра с усиленным поперечным сшиванием и иммунопреципитацией. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для идентификации на транскриптоме по его масштабу сайтов связывания РНК-связывающих белков, а также их связывающих мотивов и предпочтений.

Итак, давайте начнем. В естественных условиях УФ-сшивание начинается в бленде с ламинарным потоком. В этом протоколе мы будем использовать меченые IGF two BP one cells в качестве примерной модели с использованием стерильной техники.

Расширить HEK 2 93 клетки, стабильно экспрессирующие флаг HA, меченные IGF, два BP, один под контролем репрессора Tet в HEK 2, 93 среды для культивирования клеток, использовать от 100 до 400 раз от 10 до 6 клеток и вырастить их примерно до 80% CO бегучести. За 14 часов до сшивания клетки получали фотореактивный аналог рибозида для тиоуридина или SU непосредственно в среду для клеточной культуры. В качестве альтернативы можно использовать 6-ю гину или 6 СГ после добавления фотореактивного рибозида, индуцировать экспрессию флага HA, меченного ИФР, два АД, один из которых путем добавления доксициклиновых клеток, затем инкубируют в течение ночи в клеточном инкубаторе.

Далее сцеживаем питательную среду. Затем промойте клетки один раз 10 миллилитрами ледяного фосфатного буферного раствора на тарелку. Затем полностью удалите PBS путем декантации.

Поместите непокрытые пластины на лоток со льдом и облучите их 365 нанометровым ультрафиолетовым светом в стрэддл-линкере 2, 400 УФ-сшивателем или эквивалентом после УФ-излучения, соскоблите ячейки резиновым полицейским по одному миллилитру PBS на пластину. Переложите ячейки в центрифугирующие пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при температуре 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от суперназвания и оставьте клеточную гранулу.

На этом этапе гранулы ячеек можно мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при температуре минус 80 не менее 12 месяцев. Для продолжения процедуры reus суспендируют гранулу в трех объемах одного X NP 40 лизисного буфера и инкубируют на льду в течение 10 минут. Очистите лизат клеток центрифугированием при 13 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования дополнительно очистите лизат, отфильтровав его через мембранный шприцевой фильтр размером пять микрон. Наконец, добавьте РНК T one до конечной концентрации одна единица на микролитр и инкубируйте на водяной бане при температуре 22 градуса Цельсия в течение 15 минут. Впоследствии остудите реакцию на льду в течение пяти минут.

Последующая УФ-сшивка in vivo. Подготовьте магнитные шарики для иммунопреципитации. Перенесите 10 микролитров магнитных частиц белка G гранул dyna на один мил клеточного лизата в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра.

Затем поместите трубку с бусинами на магнитную подставку на одну-две минуты. Снимите надосадочную жидкость и добавьте в пробирку один миллилитр цитратфосфатного буфера, пока он находится на магнитном сепараторе. Далее закройте пробирку крышкой и закрутите образец, чтобы снова подвесить бусины.

Кратковременно центрифугируете, чтобы собрать все шарики, оставшиеся в крышке пробирки. Повторите эту полоскание с добавлением еще одного миллилитра цитратфосфатного буфера. После промывки суспензию гранул и цитратфосфатного буфера нарастить в объеме, в два раза превышающем первоначальный объем свекловичной суспензии.

Затем добавьте 0,25 миллиграмм Anti-Flag M двух моноклональных антител на один миллилитр взбитой суспензии. Инкубируйте суспензию на вращающемся колесе в течение 40 минут при комнатной температуре после инкубации, промойте шарики дважды в одном миллилитре цитратфосфатного буфера, как описано ранее, эта промывка служит для удаления любых несвязанных антител после промывки Резуса, суспензируйте шарики и цитратфосфатный буфер, как до четырех. Чтобы начать иммунопреципитацию, добавьте свежеприготовленные магнитные шарики с антителами к лизату клеток, обработанным Т-одной клеткой.

Переложите смесь в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров и вращайте в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации соберите магнитные шарики, выбросьте надосадочную жидкость в один миллилитр промывочного буфера IP и перенесите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Промойте шарики, как описано выше, два раза в одном миллилитре буфера для промывки IP.

После окончательной промывки восстановите валики в исходном объеме валика буфера промывки IP. Затем добавьте РНАТ один до конечной концентрации 100 единиц на микролитр. Выдержите суспензию шариков на водяной бане при температуре 22 градуса Цельсия в течение 15 минут.

Впоследствии охладите суспензию на льду в течение пяти минут. Далее промойте бусины три раза в одном миллилитре буфера с высоким содержанием соли. Затем повторно суспендируйте шарики в одном исходном объеме шариков буфера для дефосфорилирования.

Добавьте к теленку кишечную щелочную фосфатазу до конечной концентрации 0,5 ЕД на микролитр и выдержите суспензию в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте шарики дважды в одном миллилитре буфера для промывки фосфатазы, а затем еще дважды в полинуклеотидкиназе или PNK-буфере без DTT. Наконец, снова суспендируйте валики в одном исходном объеме бусин буфера PNK.

Начать радиомечение сшитой РНК. Добавьте гамму 32 PATP и T четыре PNK в один исходный объем бусин свежеприготовленной суспензии. Выдерживайте суспензию в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Далее добавьте в суспензию нерадиоактивный ТП и инкубируйте ее еще пять минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем пять раз промойте магнитные шарики 800 микролитрами буфера PNK без DTT. Наконец, снова суспендируйте бусины в 70 микролитрах страницы SDS.

Загрузочный буфер инкубирует суспензию радиометок в течение пяти минут в тепловом блоке при температуре 95 градусов Цельсия для денатурации и высвобождения иммуноосативных РНК-связывающих белков с перекрестно сшитой РНК. Затем удалите магнитные шарики на сепараторе и переложите супернатин в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра Загрузите 40 микролитров суаде на лунку сборного полиакриламидного геля от четырех до 12% и запустите гель в течение 55 минут при напряжении 200 вольт. После того, как гель истечет, разберите гелевую камеру и демонтируйте пластины, оставив гель закрепленным на одной пластине, чтобы облегчить выравнивание геля по распечатке бумаги фосфографического имиджера.

Имплантируйте три крошечных кусочка радиоактивного геля, асимметрично расположенных по углам геля. Заверните гель в полиэтиленовую пленку, такую как Saran wrap, чтобы избежать загрязнения. Подвергните гель воздействию пустого экрана фосфографического имиджера в течение одного часа, а затем на фосфо-имиджере.

Затем выровняйте гель поверх распечатки фосфоскопического имиджера, используя имплантированные кусочки геля для ориентации. Вырежьте полосы, которые соответствуют ожидаемому размеру РНК-связывающего белка или RBP. Переложите полосы в диализатор dtu на MIDI-трубку и добавьте 800 микролитров одного XSDS бегового буфера электроэлюя.

Сшитый комплекс R-N-A-R-B-P при напряжении 100 вольт в течение двух часов в соответствии с инструкциями производителя. После электроэлюирования. Добавьте буфер протеиназы К и протеиназу К, инкубируйте раствор в течение 30 минут при температуре 55 градусов Цельсия.

Восстановите РНК путем экстракции кислым фенолом хлороформа изоамиловым спиртом с последующей экстракцией хлороформом. Затем добавьте один микролитр гликогена и осадите РНК, добавив три объема этанола. Окончательно растворите полученную гранулу в 10,5 микролитрах воды.

После того, как РНК будет восстановлена, проведите ее через стандартный протокол подготовки библиотеки CDNA и проведите тщательный биоинформатический анализ прочитанных последовательностей. Репрезентативные результаты для пар-клипса, выполненного с HK 2, 93 клетками, экспрессирующими флаг H ha, меченные IGF, два BP один, показаны с фотореактивными нуклеозидными аналогами четырех SU и шести SG, эффективность сшивания альтернативного фотореактивного рибозида 6 SG в целом ниже, чем для четырех su. Более низкая эффективность сшивки может привести к более высокому фону последовательностей, полученных из фрагментов большого количества клеточных РНК, и поэтому первоначально для эксперимента следует использовать больше клеток.

Различные фотореактивные аналоги уридина par clip сравниваются с традиционным UV 2 54 нанометровым сшиванием или клипсом, как показано здесь. Сшивание белков РНК UV 2 54 нанометра имеет ограниченную эффективность сшивки. Интенсивность радиоактивной полосы соответствующего размера указывает на то, сработал ли эксперимент с par clip и было ли выделено достаточно РНК для прохождения через протокол секвенирования малых РНК.

Частота характерных мутаций в секвенированных чтениях после биоинформатического анализа свидетельствует об успешном сшивке последовательностей. Эти мутации представляют собой Т, два С-перехода, при использовании четырех SU и G, два А-перехода, при успешном использовании. G. Определяющей особенностью парковой губы является возможность определения местоположения поперечной линии путем оценки характерной мутации, находящейся в библиотеках CD NA, полученных из восстановленных РНК.

Это позволяет легко отделить сигнал, полученный от специфически связанных РНК, от шума последовательностей, полученных из совместно изолированных фрагментов распространенных клеточных РНК. Итак, сегодня мы показали вам, как выделить сегменты РНК, специфически распознаваемые РНК-связывающими белками. При этом делать эту процедуру.

Важно работать с РНК свободно. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в экспериментах.