Визуализация экспрессии белка на основе CUBIC: процедура визуализации экспрессии белка при биопсии кожи мыши полной толщины

- Кожа – это сложный орган, состоящий из различных клеточных популяций, расположенных в нескольких слоях. CUBIC, метод трехмерной визуализации, основанный на очищении тканей, помогает визуализировать паттерны экспрессии белков внутри этих клеток кожи с помощью биопсии всей кожи. Начните с того, что возьмите усыпленную мышь и удалите шерсть с ее спинной части шеи. Отрежьте кусок кожи и нарежьте его небольшими кусочками.

Погрузите кусочки в раствор для очистки CUBIC1 и инкубируйте. Клетки кожи непрозрачны, благодаря наличию хромофоров и липидов, вызывающих рассеяние света. Химические вещества в растворе CUBIC удаляют эти молекулы, тем самым уменьшая рассеяние света и делая ткань прозрачной.

Затем обработайте ткань желаемыми первичными антителами, которые специфически связываются со своими целевыми внутриклеточными белками, экспрессируемыми в клетках кожи. Кроме того, проводите лечение флуоресцентно меченными вторичными антителами, которые связываются с комплексами белок-первичные антитела. Покрасьте ткань ДНК-связывающим красителем, который окрашивает ядро.

Наконец, погрузите образец в раствор CUBIC2. Раствор еще больше уменьшает рассеяние света внутри ткани, делая ее более прозрачной для визуализации. Наблюдайте под конфокальным микроскопом, чтобы визуализировать флуоресцентно меченные области интереса в трехмерном образце. Следующий протокол позволяет визуализировать экспрессию маркеров пролиферации кератиноцитов в биопсии кожи всего массива с использованием протокола CUBIC.

- Начните с использования триммеров для бритья волос на шее усыпленной мыши, стараясь не ранить кожу. Затем обеззаражьте кожу 70% этанолом в PBS. Затем подтяните кожу спинной части шеи с помощью щипцов и с помощью ножниц удалите участок кожи спинной мыши размером примерно 1,5 на 4 сантиметра. Затем расплющите кожу дермой вниз на листе фильтровальной бумаги, отмечая передне-заднюю ориентацию образца, и обрежьте бумагой вокруг рассеченной кожи.

- Для оптимальной визуализации образцы кожи должны оставаться плоскими с постоянной ориентацией волосяных фолликулов. Чтобы сохранить образцы в правильном передне-заднем положении, мы фиксируем кусочки кожи на фильтровальной бумаге в прямоугольных биопсиях.

- Переложите образцы в 15-миллилитровую пробирку, наполненную свежеприготовленным 4% PFA в PBS. Затем, когда они будут прочно закреплены на фильтровальной бумаге, переложите образцы в новую 15-миллилитровую трубку PBS на две 5-минутные промывки.

Чтобы очистить биопсию кожи после второго промывки, используйте острое лезвие бритвы, чтобы разрезать ткани примерно на кусочки размером 0,2 на 0,5 сантиметра, следя за тем, чтобы более длинные стороны образцов были разрезаны вдоль передне-заднего направления образцов.

- Разрезание более длинной стороны биопсии параллельно ориентации волосяных фолликулов также помогает избежать обширного повреждения волосяных фолликулов.

- Затем погрузите биопсию в 5 миллилитров свежеприготовленного очищающего раствора CUBIC1 в новую 15-миллилитровую пробирку и поместите пробирку на вращающуюся платформу в гибридизационную печь при температуре 37 градусов Цельсия. После того, как кусочки ткани станут прозрачными, промойте биопсию в 4 миллилитрах PBS в течение четырех 6-часовых промываний при 37 градусах Цельсия, а затем 4-часовую промывку 37 градусов Цельсия с 20% весом на объем сахарозы в PBS.

В конце инкубации заморозьте каждый образец в компаунде с оптимальной температурой резки в отдельных пробирках объемом 15 миллилитров на ночь при температуре минус 80 градусов Цельсия для повышения проницаемости тканей для проникновения антител.

На следующее утро окрасьте образцы кожи соответствующими антителами и жизненно важными красителями, представляющими интерес. Затем инкубируйте образцы в 1 миллилитре свежеприготовленного очищающего раствора CUBIC2 в 2 миллилитровых пробирках на шейкере в течение 24 часов в духовке при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы выровнять показатель преломления тканей.

Когда ткани станут чистыми, расположите биопсию вдоль длинной стороны отдельных стеклянных покровных стекол таким образом, чтобы направление роста волосяного фолликула было параллельно поверхности покровного стекла. Нанесите одну каплю раствора CUBIC2 на ткань. Положите две полоски 1 миллиметра на 2 сантиметра синей прихватки на покровный лист. Затем накройте биопсию вторым покровным листком.

Затем поместите камеру визуализации на предметный столик для конфокального микроскопа и переместите ткань в световой путь. Используя соответствующий источник света и стандартные эпифлуоресцентные фильтры, отсканируйте образец, чтобы определить флуоресцентно окрашенные области, представляющие интерес. Затем получите флуоресцентные конфокальные изображения интересующих областей.