Количественное экспрессии белка и совместной локализации Использование Multiplexed иммуногистохимическое окрашиванием и мультиспектральных визуализации

Общая цель данного метода заключается в объективной количественной оценке экспрессии и колокализации белков с помощью мультиспектральной визуализации. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области фундаментальных исследований и диагностической патологии, например, о том, как меняются экспрессия и локализация белков после лечения или при прогрессировании заболевания. Основным преимуществом данной техники является устранение субъективности оператора, присущей традиционным методам количественного анализа.

Для начала процесса количественного анализа откройте программное обеспечение для мультиспектральной визуализации, чтобы создать спектральную библиотеку на основе ранее подготовленных контрольных предметных стекол, окрашенных отдельными хромогенами, а также стекла, окрашенного гематоксилином. Затем откройте изображение-куб, полученное с контрольного стекла, и выберите четыре или пять областей с положительным окрашиванием для оптического определения хромогена. Повторите эти действия с изображениями-кубами других контрольных стекол до тех пор, пока не будет создана полная спектральная библиотека, представляющая все хромогены, после чего сохраните спектральную библиотеку.

Начните новый проект в программном обеспечении для мультиспектрального анализа, выбрав Multispectral или im3 в качестве формата изображения и Brightfield в качестве формата образца. Настройте проект, выбрав пункты segment tissue, find features, phenotyping, score и export. При необходимости измените разрешение изображения, чтобы ускорить время анализа.

Импортируйте ранее созданную спектральную библиотеку и выберите все хромогены, которые должны быть включены в анализ. Откройте имидж-кубы, которые будут включены в обучающий набор данных, выбрав опцию Open Image Cube. Чтобы обеспечить точность обучения, выберите не менее 18% от общего количества анализируемых изображений.

Далее выберите обучающий набор изображений. Чтобы повысить точность сегментации, используйте изображения, представляющие все состояния заболевания. Включите в обучающий набор достаточное количество изображений с негативным контрастированием, чтобы избежать систематической ошибки на данном этапе.

Выполните баланс белого для изображений в обучающей выборке, выбрав инструмент «пипетка» и указав область белого цвета на одном из изображений. Нажмите кнопку «далее» (advance), чтобы перейти к сегментации ткани. Затем воспользуйтесь панелью категорий тканей, чтобы выбрать типы тканей для анализа; для более точной локализации белков в тканях можно использовать выбор категорий тканей.

Начните создание алгоритма и определение категорий тканей, используя инструмент «перо» (pen tool) для обводки групп клеток на обучающих изображениях. После завершения работы с одной категорией тканей повторите этот шаг для остальных категорий. Убедитесь, что выбранные на изображениях группы клеток являются характерными для данного типа категории ткани.

Выберите компоненты, которые будут включены в обучение сегментатора тканей. Выберите подходящий масштаб паттернов для обучения сегментатора тканей. Затем нажмите кнопку обучения сегментатора тканей.

Обратите внимание на всплывающее окно, отображающее точность доли пикселей в правильно классифицированных областях обучения. Выполните сегментацию всего обучающего набора изображений, нажав кнопку «segment images». По завершении просмотрите обучающий набор, чтобы выявить любые неправильно классифицированные ткани с использованием текущего алгоритма обучения.

Когда результаты алгоритма сегментации ткани станут удовлетворительными, нажмите кнопку advance. Убедитесь, что параметр nuclei уже выбран, чтобы иметь возможность выбрать cytoplasm и/или membrane. Перейдите на вкладку nuclei и установите соответствующие параметры для сегментации ядер.

Затем выберите, будут ли при сегментации учитываться отдельные категории тканей или все сразу. Для использования упрощенного метода получения качественных результатов выберите подход с пороговым значением на основе объекта контрастного окрашивания. Далее выберите подход с пороговым значением на основе объекта при наличии надежного ядерного контрастного окрашивания.

Выберите параметры формы цитоплазмы, перейдя на вкладку cytoplasm. Затем выберите расстояние от ядра до внешней границы (outer distance to nucleus). После этого выберите минимальный размер (minimum size).

Выберите следующий компонент опции с первичным, вторичным и выберите третичный в качестве вторичных опций. Перейдите на вкладку «Мембрана». Выберите первый вариант для используемого специфического маркера мембраны.

Отрегулируйте полную шкалу оптической плотности (OD), чтобы определить минимальный порог или положительный сигнал для каждого маркера на клеточных мембранах. Далее, во вкладке «membrane», выберите максимальный размер клетки. После выбора всех параметров нажмите «segment all».

Примените настройки к изображениям и изучите их. Выберите «advance», чтобы перейти к этапу оценки ИГХ, и выберите категорию ткани для оценки. Выберите желаемый тип оценки и клеточный компартмент, который будет использоваться в анализе оценки.

Затем выберите просмотр данных компонентов и переместите курсор по обучающим изображениям, чтобы определить подходящий минимальный порог оптической плотности окрашивания для положительных клеток интересующих компонентов. Экспортируйте данные обучающей выборки для проверки алгоритма, созданного с помощью сегментации ткани, сегментации клеток и определения значений оценки; следуйте подсказкам для создания новой папки в директории экспорта. Выберите изображения и таблицы, которые должны быть созданы и включены в анализ.

Затем проведите анализ, выбрав экспорт для всех объектов. По завершении анализа просмотрите данные по сегментации клеток и количественной оценке для изображений как с интенсивным, так и со слабым окрашиванием, чтобы оценить точность настроек. После того как настройки будут определены, перейдите на вкладку пакетного анализа, чтобы скопировать алгоритм в активный проект.

Затем выберите новую директорию для экспорта и отметьте изображения и таблицы, которые должны быть включены в анализ. В опции входных файлов (input files) выберите все изображения для пакетного анализа. Выберите опцию запуска (run) для выполнения анализа.

По завершении перейдите на вкладку review merge. Выберите include all и нажмите merge, чтобы создать таблицы данных со сводными данными для анализа. Обучение проводилось на тканях предстательной железы для сегментации изображений на эпителиальные и стромальные части.

Вместе с отделением, не содержащим ткани. В программное обеспечение для мультиспектральной визуализации был импортирован набор обучающих изображений, представляющих типы тканей и патологические состояния всей совокупности снимков. Были созданы категории тканей, включая строму, эпителий и нетканевые области; категории были определены путем ручного выделения областей на обучающих изображениях.

Был разработан алгоритм сегментации тканей, который был применен к обучающему набору изображений для точного выделения тканей. С помощью метода мультиплексного иммуногистохимического анализа были идентифицированы клетки с положительной ядерной экспрессией ER-alpha (красный цвет) и AR (коричневый цвет), несмотря на перекрытие цветовых и метрических сигналов. Количественная оценка специфической экспрессии CD-147 на клеточной мембране проводилась с использованием E-catherine (черный цвет) в качестве маркерного белка.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как количественно определить экспрессию белков и их колокализацию в фиксированных в парафине тканях.