Количественное экспрессии белка и совместной локализации Использование Multiplexed иммуногистохимическое окрашиванием и мультиспектральных визуализации

Иммуногистохимия — это мощный лабораторный метод для оценки локализации и экспрессии белков в тканях. Современные полуавтоматические методы количественной оценки вносят субъективность и часто приводят к невоспроизводимым результатам. В данной работе мы описываем методы мультиплексной иммуногистохимии и объективного количественного определения экспрессии и колокализации белков с использованием мультиспектральной визуализации.

Общая цель этого метода заключается в объективной количественной оценке экспрессии белка и колокализации с использованием мультиспектральной визуализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фундаментальных исследований и диагностической патологии, например, как изменяется экспрессия и локализация белков после лечения или при прогрессировании заболевания. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она устраняет операторную субъективность, присущую традиционным методам количественной оценки.

Чтобы начать процесс количественной оценки, откройте программное обеспечение для мультиспектральной визуализации, чтобы создать спектральную библиотеку из предварительно подготовленных контрольных стекол, окрашенных отдельными хромогенами, и окрашенного гематоксилином предметного стекла. Затем откройте куб изображения, полученный с контрольного слайда, и выберите четыре-пять положительно окрашенных областей для оптического определения хромогена. Повторите шаги с кубами изображений с других управляющих слайдов, пока не будет создана полная спектральная библиотека, представляющая все хромогены, а затем сохраните спектральную библиотеку.

Начните новый проект в программном обеспечении для мультиспектральной визуализации, выбрав Мультиспектральный или im3 для параметра формата изображения и Светлое поле для формата образца. Настройте проект, выбрав ткань сегмента, найдите признаки, фенотипирование, оценку и экспорт. При необходимости измените разрешение изображения, чтобы ускорить время анализа.

Импортируйте ранее созданную спектральную библиотеку и выберите все хромогены, которые будут включены в анализ. Откройте кубы изображений, которые будут включены в набор обучающих данных, выбрав параметр Открыть куб образа. Выберите не менее 18% от общего числа анализируемых изображений, чтобы обеспечить точность обучения.

Далее выберите обучающий набор изображений. Изображения, представляющие все состояния заболевания, для повышения точности сегментации. Включите в обучающий набор большое количество изображений негативного окрашивания, чтобы избежать смещения на этом этапе.

Баланс белого для изображений в обучающем наборе путем выбора инструмента «Пипетка» и выбора белой области на одном изображении. Нажмите кнопку «Вперед», чтобы переместить сегментацию тканей. Затем используйте панель категорий тканей для выбора типов тканей для анализа для более точной локализации белковых тканей, можно использовать выбранные категории тканей.

Начните создание алгоритма и определение категорий тканей с помощью инструмента «Перо» и рисования вокруг групп клеток в обучающих изображениях. Закончив с одной категорией тканей, повторите шаг для других категорий тканей. Обязательно выбирайте группы клеток на изображениях, характерные для типа категории ткани.

Выберите компоненты, которые будут включены в обучение для сегментера тканей. Выберите подходящую шкалу шаблона для тренировки сегментера тканей. Затем нажмите кнопку тренированного сегментатора тканей.

Обратите внимание на всплывающее окно, отображающее точность доли пикселей в правильно классифицированных областях обучения. Сегментируйте весь обучающий набор изображений, щелкнув сегментировать изображения. По завершении просмотрите обучающий набор, чтобы найти любую неправильно классифицированную ткань с помощью текущего алгоритма обучения.

Если вы уверены в результатах алгоритма сегментации тканей, нажмите кнопку «Вперед». Убедитесь, что ядра уже выбраны для выбора цитоплазмы и/или мембраны. Выберите вкладку ядер и выберите подходящие настройки для сегментации ядра.

Затем выберите, будут ли отдельные или все категории тканей включены в сегментацию. Выберите подход на основе пороговых значений на основе объекта counterstain для упрощенного метода получения хороших результатов. Затем выберите объектно-ориентированный пороговый подход на надежном ядерном противопятне

Выберите параметры формы цитоплазмы, выбрав вкладку цитоплазма. Далее выберите внешнее расстояние до ядра. Затем выберите минимальный размер.

Выберите следующий компонент опции с первичным, вторичным и выберите третичный в качестве вторичных опций. Перейдите на вкладку мембраны. Сначала выберите для мембраны конкретный используемый маркер.

Отрегулируйте полную оптическую плотность или ОД, чтобы найти минимальный порог или положительное значение для каждого маркера на клеточных мембранах. Продолжая под вкладкой мембраны, выберите максимальный размер ячейки. После выбора всех вариантов выберите сегментировать все.

Примените настройки к изображениям и наблюдайте за ними. Выберите advance, чтобы перейти к этапу оценки IHC, и выберите категорию тканей для оценки. Выберите нужный тип оценки и выберите ячейку ячейки, которая будет использоваться в анализе оценки.

Затем выберите просмотр данных компонента и наведите курсор на обучающие изображения, чтобы найти подходящую оптическую плотность минимального порога окрашивания для положительных ячеек для интересующих компонентов. Экспортируйте данные для обучающего набора, чтобы проверить алгоритм, созданный с помощью сегментации тканей, сегментации клеток и оценки значений, следуйте инструкциям, чтобы создать новую папку для каталога экспорта. Выберите изображения и таблицы для создания и включения в анализ.

Затем выполните анализ, выбрав экспорт для всех. Когда анализ будет завершен, просмотрите данные сегментации ячеек и оценки для изображений с высоким и низким окрашиванием, чтобы оценить точность настроек. После того, как вы будете удовлетворены настройками, нажмите на вкладку «Пакетный анализ», чтобы скопировать алгоритм в активный проект.

Затем выберите новую директорию экспорта и выберите изображения и таблицы для включения в анализ. В разделе «Входные файлы» выберите все изображения, которые будут включены в пакетный анализ. Выберите опцию run для выполнения анализа.

После завершения перейдите на вкладку «Просмотреть слияние». Выберите «Включить все» и нажмите «Объединить», чтобы создать листы данных со сводными данными для анализа. Обучение проводилось на тканях предстательной железы для сегментации изображений на эпителиальную и стромальную части.

Вместе с нетканевым отсеком. Набор обучающих изображений был импортирован в программное обеспечение для мультиспектральной визуализации, представляющее типы тканей и болезненные состояния всего набора изображений. Были созданы категории тканей, включая строму, эпителий и нетканевые категории, а категории были определены путем ручного рисования поверх обучающих изображений.

Был создан алгоритм сегментации тканей, который был применен к обучающему набору изображений. Точная сегментация тканей. С помощью метода мультиплексной иммуногистохимии клетки, положительные на ядерную экспрессию ER-альфа, видимые как красные, и AR, видимые как коричневые, были идентифицированы, несмотря на перекрывающиеся цветовые и метрические сигналы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как количественно определять экспрессию белка и ко-локализацию, информировать и фиксировать ткани, залитые парафином.