Аксоплазме Изоляция от седалищного нерва крысы

Общая цель этой процедуры заключается в выделении чистой аксональной цитоплазмы или эктоплазмы из периферических нервов. Это достигается путем предварительного рассечения седалищного нерва. Вторым этапом процедуры является удаление соединительной ткани из нерва и отделение срезов.

Третьим этапом процедуры является инкубация коротких сегментов нервных слеток в гипотонической среде. Завершающим этапом процедуры является инкубация в изотоническом растворе, центрифугирование и опсм-милиан. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают высокую степень обогащения аксональных компонентов с помощью вестерн-блоттинга.

Привет, меня зовут я, Эль И я могу Розенбаум. Мы из лаборатории профессора Майка Ф. Лабора Департамента биологической химии на базе Института науки. Сегодня мы представим новую технику оксиопатного мезилирования.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как ручное сжатие ОИС периферического нерва. То есть при этой процедуре уменьшается загрязнение сыворотки и глос, достигает аксонального содержимого. Мы использовали эту новую технику метилирования op PLAs для изучения ретро-сигнализации на основе D после повреждения седалищного нерва.

Итак, приступим. Положите одну из двух усыпленных восьми-10-недельных крыс вистар на бок на коврик для прямого доступа к дистальной части седалищного нерва. Выбрейте кожу в середине бедра и тщательно замените 70% этанолом.

С помощью ножниц срежьте кожу с бедра. Осторожно разрежьте жировую и соединительную ткань между бедренными бицепсами и поверхностными ягодичными мышцами. С помощью щипцов приподнимают оголенную область седалищного нерва и удаляют ее.

Снятый участок будет иметь длину примерно 1,5 сантиметра. Переведите нерв в 500 микролитров ледяного 2X PBS с ингибиторами протеазы в микроцентрифужную пробирку. Держите трубку на льду.

Повторите процедуру вскрытия с другой стороны крысы и с обеих сторон второй крысы. Поцарапать дно чашки Петри пастевой пипеткой и наполнить ее двумя миллилитрами комнатной температуры. Точка два X PB s с ингибиторами протеазы.

Перенесите один нерв в чашку под препарирующим микроскопом. С помощью тонких щипцов удалите epi nearium из нерва, оттянув его, и выбросьте, оставив поверхности в чашке. Тщательно отделите фасиле друг от друга и дна блюда.

Отдельные фали помутнеют и будут плавать на поверхности раствора. Немедленно перенесите отделенные фалы в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 микролитров 0,2 X PB s с ингибиторами протеазы. Держите слайсы на льду.

Отделите и соберите слеи из оставшегося в пробирке седалищного нерва с практикой. Удаление эпиневриума и отделение слонов. Должно занимать не более 10 минут на один нерв.

Извлеките изо льда трубку, содержащую отделенный SLES. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре, чтобы высвободить миелин и вши неаксональные структуры. Мойте слески для каждой стирки.

С помощью щипцов осторожно приподнимите слеи и переложите их в свежую пробирку, содержащую один миллилитр 2X PB s с ингибиторами протеазы. Встряхивайте трубку на коромысле в течение пяти минут. Промойте SLES таким образом три раза после стирки.

Переложите SLES в свежую пустую эйноровую пробирку для удаления лишней жидкости, а затем переложите в пробирку, содержащую 300 микролитров одного XPBS с протейными ингибиторами, инкубируйте при комнатной температуре в течение 20-30 минут. Для размывания опсм более высокие концентрации солей препятствуют дальнейшим процедурам протеомики. Центрифугируйте пучок при 10 000 сыра в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы откачать ткань и клеточный мусор пипеткой из надосадочной жидкости в чистую эйнорскую пробирку.

Надосадочная жидкость получена. Должно быть понятно. Используйте спектрофотометр для измерения концентрации белка.

Должен быть получен выход от 200 до 250 микрограммов белка. Препарат оп плазмы хранить в аликвотах при температуре минус 80 градусов Цельсия до шести месяцев. Избегайте циклов размораживания и замораживания.

Ниже приведен западный блок, в котором сравнивается op-плазма, выделенная методом ручного сжатия, с образцами opsm, выделенными, как показано в этом протоколе. Обратите внимание на снижение уровней альбумина и GFAP, представляющих собой контаминацию белка крови и глиальных клеток соответственно. Напротив, аксональный тубулин бета-три обогащен этим препаратом, что указывает на высокий уровень аксональных белков.

После просмотра всего этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как препарировать атический нерв и как правильно отделить Пако. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.