Аксоплазме Изоляция от седалищного нерва крысы

Общая цель данной процедуры заключается в выделении чистого аксонального цитоплазматического или эктоплазматического содержимого из периферического нерва. Сначала осуществляется препарирование седалищного нерва. Вторым этапом процедуры является удаление соединительной ткани из нерва и отделение отдельных волокон.

Третьим этапом процедуры является инкубация коротких сегментов нервных волокон в гипотонической среде. Заключительный этап процедуры включает инкубацию в изотоническом растворе, центрифугирование и осмос-мильянизацию. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие высокую степень обогащения аксональными компонентами по данным вестерн-блот-анализа.

Здравствуйте, меня зовут Эль Розенбаум. Мы представляем лабораторию профессора Майка Ф. Лаборатории биологической химии Института науки. Сегодня мы представим новую методику оксипатометилирования.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как ручное сжатие при OIS периферических нервов, является то, что эта процедура снижает загрязнение содержимого аксонов сывороткой крови и глией. Мы применили этот новый метод для метилирования op PLAs с целью изучения ретроградной сигнализации, зависящей от D, после повреждения седалищного нерва.

Итак, приступим. Положите одну из двух эвтаназированных крыс линии Wistar в возрасте от 8 до 10 недель на бок на препароционный коврик для обеспечения прямого доступа к дистальной части седалищного нерва. Выбрейте шерсть в средней части бедра и тщательно протрите кожу 70% этанолом.

С помощью ножниц удалите кожу с бедра. Осторожно прорежьте жировую и соединительную ткани между двуглавой бедренной мышцей и поверхностной ягодичной мышцей. Используя пинцет, приподнимите обнаженный участок седалищного нерва и извлеките его.

Длина удаленного сегмента составит примерно 1,5 сантиметров. Перенесите нерв в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 µL ледяного 2X PBS с ингибиторами протеаз. Храните пробирку на льду.

Повторите процедуру диссекции с другой стороны крысы, а также с обеих сторон второй крысы. Протрите дно чашки Петри пастеровской пипеткой и наполните ее двумя миллилитрами комнатной температуры 2X PBS с ингибиторами протеаз.

Перенесите один нерв в чашку под dissecting microscope. С помощью тонкого пинцета удалите эпиневралий с нерва, оттянув его, и выбросьте его, оставив пучки (fascicles) в чашке. Осторожно отделите пучки друг от друга и от дна чашки.

Отдельные фалес станут мутными и всплывут на поверхность раствора. Немедленно перенесите отделенные фалес в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 µL 0,2 X PB s с ингибиторами протеаз. Храните фалес на льду.

Опытным путем отделите и соберите пучки нервных волокон из оставшейся части седалищного нерва в пробирке. Удаление эпиневрия и выделение пучков должно занимать не более 10 минут на один нерв.

Извлеките пробирку с отделенными SLES изо льда. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для высвобождения миелина и неаксональных структур. Промойте sles при каждой процедуре промывки.

С помощью пинцета осторожно поднимите sles и перенесите их в новую пробирку, содержащую 1 mL 2X PB s с ингибиторами протеаз. Перемешивайте пробирку на рокерe в течение пяти минут. Таким образом промойте SLES трижды после основной промывки.

Перенесите SLES в новую пустую пробирку типа «Эппендорф», чтобы удалить избыток жидкости, а затем перенесите в пробирку, содержащую 300 µL 1×PBS с ингибиторами протеаз; инкубируйте при комнатной температуре от 20 до 30 минут. Для элюции opsm более высокие концентрации соли препятствуют дальнейшим процедурам протеомики. Центрифугируйте образец при 10 000 ×g в течение 10 минут при 4 °C для осаждения тканей и клеточного дебриса, после чего перенесите супернатант пипеткой в чистую пробирку типа «Эппендорф».

Полученный супернатант должен быть прозрачным. Используйте спектрофотометр для измерения концентрации белка.

Должен быть получен выход белка от 200 до 250 мкг. Храните препарат плазмы опилиантов аликвотами при температуре -80 °C в течение до шести месяцев. Избегайте циклов замораживания и размораживания.

На представленном вестерн-блоте проведено сравнение проб op plasm, выделенных методом ручного сжатия, с пробами opsm, выделенными согласно данному протоколу. Обратите внимание на снижение уровней альбумина и GFAP, представляющих загрязнение белками крови и глиальными клетками соответственно. Напротив, содержание бета-III-тубулина аксонов в данной подготовке повышено, что указывает на высокую концентрацию аксональных белков.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как препарировать седалищный нерв и как правильно выделить Paco. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.