Визуализация Митохондриальная ДНК репликации в отдельных клетках путем усиления сигнала EDU

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обозначить и визуализировать репликацию M-T-D-N-A в культивируемых нейронах. Это достигается путем первичной инкубации нейронов с аналогом тимидина EDU в течение от 2 до 24 часов. Вторым этапом процедуры является маркировка EDU, содержащего алкин, флуоресцентным азидом оргона зеленого 4 88 с помощью ковалентной реакции, катализируемой медью.

Заключительным этапом процедуры является амплификация оргонового зеленого сигнала на этапе амплификации арамидного сигнала для визуализации EDU, который был включен во вновь синтезированную МТ ДНК. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают репликацию ДНК MT в конкретных субклеточных компартментах нейронов посредством комбинации химии clicka EDU и последующего усиления сигнала слезного мозга. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как мечение BRDU, заключается в том, что EDU-мечение является более простым и мягким, что позволяет проводить дополнительное иммунофлуоресцентное окрашивание нейрональных маркеров.

Этот метод может ответить на ключевые вопросы регуляции количества митохондрий, например, как нейроны реагируют на изменяющиеся энергетические нагрузки в своих субклеточных компартментах, включая клеточные тела, аксоны, дендриты и синаптические окончания. Таким образом, этот метод может дать представление о механизмах, лежащих в основе патогенеза множественных митохондриальных неврологических заболеваний, включая невропатию и нейродегенерацию. Но важно то, что он также может быть применен к другим системам, где изменения в копии митохондриальной ДНК, вероятно, лежат в основе патогенеза состояния заболевания, включая токсичность лекарств, рак и старение.

В этом видео будет показано, как пометить вновь синтезированную митохондриальную ДНК сокращенно M-T-D-N-A в ганглиозных нейронах дорсальных корешков, которые были выращены на стерильных 12-миллиметровых стеклянных покровных листах. В 24-луночном культуральном планшете разбавьте 10 миллимолярный запас из пяти этаноловых двух доксиуридинов, сокращенно EDU из набора для анализа Clicka EDO Microplate от одного до 100 в питательной среде для 10 запаса XEDU. Затем 10 запасов XEDU добавляют непосредственно в среду в каждой лунке, инкубируют обработанные нейроны в течение от двух до 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в вытяжном шкафу.

Зафиксируйте нейроны в 2%-ном параформном альдегиде на 10-15 минут при комнатной температуре. Стирайте дважды в одном XPBS по две-пять минут каждую стирку. Фиксированные нейроны могут храниться в свежем XPBS при четырех градусах Цельсия до одного месяца.

Подготовьте влажную камеру, как описано в сопроводительном тексте. С помощью щипцов с тонкими наконечниками перенесите 28 фиксированных покровных стекол, включая положительный и отрицательный контроль EDU, на листы гидрофобной параформы М внутри влажной камеры. Повторно нанесите от 200 до 300 микролитров одного XPBS, чтобы покрыть поверхность каждого покровного стекла.

Подготовьте набор для анализа click it, как описано в тексте, а также в инструкциях производителей и для маркировки митохондриальной ДНК в дозе от 75 до 80 микролитров проницаемого раствора, содержащего 0,1% триттона X в одном XPBS, на каждую крышку, слип, крышку и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 10 минут. Используйте пипетку для переноса лампы с наконечником объемом 200 микролитров, прикрепленным к концу. Для мягкого удаления жидкости без потери клеток.

С помощью пипетки для лампочки аккуратно залейте крышку. Смешайте с 200-300 микролитрами одного XPBS, чтобы тщательно вымыть предыдущий раствор. Постирайте каждый чехол дважды.

Нанесите от 75 до 80 микролитров свежей 1%-ной перекиси водорода в одном XPBS на каждую крышку. Инкубировать под крышкой в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы погасить активность эндогенной пероксидазы. Дважды промойте одним XPBS, как и перед тем, как только что приготовить коктейль click at reaction, как подробно описано в сопроводительном тексте.

Перемешайте его по трубам вверх и вниз. Не постфиксируйте нейроны вихрем с помощью от 75 до 80 микролитров фиксатора EDU на каждую крышку, слип, инкубируйте комнатную температуру в течение пяти минут. Во время постфиксной инкубации разбавьте реакционный коктейль равным объемом фиксатора clicka EDU.

Добавьте реакционный коктейль в каждую крышку для защиты от света и выдерживайте при комнатной температуре в течение 25 минут. Аккуратно удалите реакцию коктейля дважды разбавленным одним блокирующим буфером под эпифлуоресцентным микроскопом. Проверьте наличие зеленого окрашивания оргона в ядрах после завершения окрашивания EDU.

Начните усиление термитного сигнала или TSA, добавьте 1% раствор блока TSA в каждую крышку и инкубируйте комнатную температуру в течение 30 минут. Кратковременно вращайте антитело зеленого пероксидазы хрена, конъюгированный запас антител, приготовленный за 2-24 часа до ТСА, разведите первичное антитело от одного до 300 в растворе блокировки ТСА и переверните или пипеткой, чтобы перемешать узел, застегните вихрь. Добавьте по 75 микролитров в каждую крышку, смешайте и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день трижды промыть одним XPBS при комнатной температуре. Инкубируйте покровные стекла в окончательной промывке еще от 30 до 60 минут, чтобы убедиться, что несвязанное первичное антитело удалено. Подготовьте реакцию IDE в соответствии с текстовой частью этого протокола непосредственно перед использованием.

Инкубируйте покровные стекла с реакцией IDE в течение 15 минут при комнатной температуре. Трижды промыть одним XPBS, инкубируя в окончательной промывке от 30 до 60 минут, как и раньше под микроскопом. Проверьте наличие успешно окрашенных нейронов МТ ДНК на предметных стеклах с помощью монтажной среды ANTIFA, содержащей DPI, показанные здесь репрезентативные дифференциально-интерференционно-контрастные изображения ганглиозных нейронов эмбрионального и взрослого дорсального корешка, которые обычно используются для анализа.

На этих принципиальных схемах представлена процедура маркировки EDU в MTD NA зеленым флуоресцентным сигналом. Митотически активные клетки нейробластомы F 11 служат положительным контролем и иллюстрируют паттерн мечения EDU, который был включен в ядерную и митохондриальную ДНК в этих репрезентативных флуоресцентных изображениях, наложенных на яркое поле. Зеленые точечные сигналы показывают усиленный сигнал EDU, включенный во вновь синтезированный M-D-D-N-A как эмбриональных, так и взрослых ганглиозных нейронов дорсального корня.

Процедура мечения EDU позволяет проводить последующее иммунофлуоресцентное окрашивание нейронных маркеров, таких как нейрофиламенты, в красный цвет. На этих принципиальных схемах представлена процедура маркировки EDU и MTD NA красным флуоресцентным сигналом. Митотически активные клетки нейробластомы F 11 служат положительным контролем и иллюстрируют паттерн маркировки EDU, который был включен в ядерную и митохондриальную ДНК.

На данной принципиальной схеме показана процедура маркировки BRDU во вновь синтезированном M-T-D-N-A зеленым или красным флуоресцентным сигналом. При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать запускать контрольные группы с использованием митотически активных клеток, чтобы проверить успешное мечение EDU и ядра клеток, прежде чем переходить к шагам амплификации для визуализации маркировки MT DNA. Другие методы, такие как стандартная иммунофлуоресценция, могут быть применены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как регулируется синтез митохондриальной ДНК в конкретных субпопуляциях нейронов или нейронных компартментах.

Неврологические состояния.