Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы определить субмитохондриальную локализацию киназы нормального ядерного клеточного цикла, а затем проанализировать, как ее митохондриальная локализация влияет на прогрессирование клеточного цикла. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области митохондриальных исследований, например, как ядро взаимодействует с митохондриями во время клеточного цикла. Помечая белки ведущей последовательностью митохондрий, мы можем извлечь выгоду из экспрессии белка в митохондриях, чтобы изучить их функции, специфичные для митохондрий.

Хотя этот метод может дать представление о митохондриях, нацеленных на определенные белки, он также может быть применен к другим органеллам, таким как ядро, ER, Гольджи и лизосома. После культивирования, гомогенизации и гранулирования клеток в соответствии с текстовым протоколом перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. И центрифугируйте образец при 7 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем используйте 200 микролитров ледяного буфера IBC для ресуспендирования гранулы и разделите гомогенат на две аликвоты. Снова центрифугируйте образцы при 7 000 g и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. И повторите стирку.

После удаления надосадочной жидкости добавьте 30 микролитров буфера для лизиса клеток в одну из гранул и храните лизат при температуре 80 градусов Цельсия для иммуноблоттинга. Для проведения экстракции карбоната натрия второй гранулой для разделения растворимых и мембраносвязанных белков добавляют 250 микролитров 0,1 молярного карбоната натрия pH 11,0, и выдерживают на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте при 100, 000 г в течение 20 минут.

Затем соберите надосадочную жидкость и добавьте равный объем свежеприготовленной, 20% трихлоруксусной кислоты для осаждения белков. Держать на льду 30 минут. Тем временем добавьте в гранулу 30 микролитров буфера для лизиса клеток и обеспечьте ультразвуком согласно текстовому протоколу перед хранением при температуре 80 градусов Цельсия для иммуноблоттинга.

После 30-минутной инкубации ТСА центрифугируйте реакцию при 15 000 г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, затем используйте 80 микролитров буфера для лизиса клеток для ресуспендирования гранулы. После выделения митохондриальных фракций из клеток, как описано в текстовом протоколе, разделите митохондриальные фракции на 10 равных частей.

Гранулируйте образцы при температуре 7 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Используйте 30 микролитров буферов гипотонической сахарозы различной концентрации с трипсином или без него, чтобы растворить каждую гранулу. И инкубировать на льду в течение 30 минут.

Добавьте 3 микролитра 10 миллимолярных PMSF в флаконы, содержащие трипсин, чтобы остановить расщепление трипсина. И выдерживать на льду в течение 10 минут. Центрифугируйте образцы при 14 000 g и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

И переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Чтобы лизировать гранулу, добавьте 30 микролитров буфера для лизиса клеток. Обработайте образцы ультразвуком, как описано в текстовом протоколе, и храните при температуре 80 градусов Цельсия.

Для создания митохондрий, нацеленных на GFP/RFP-меченные векторы cyclinB-1 Cdk-1, клонировать митохондриальную последовательность, нацеленную на превенцию субъединицы цитохром-с-оксидазы человека 8A, и создать каркас с n-концом GFP или RFP в сайтах Nhe1 и bAmH1, pEGFP-N1 или pERFP-N1, используя стандартные методы молекулярного клонирования. Используя праймеры, изложенные в текстовом протоколе, амплифицируйте гены Cdk1 и циклинB1 в соответствии со стандартными методами. Затем используйте BamH1 для переваривания продуктов ПЦР.

Запустите реакцию на 1%-ном агарозном геле, прежде чем с помощью лезвия бритвы вырезать фрагменты ДНК нужного размера. Затем используйте набор для экстракции геля для очистки ДНК. Далее расщепите один микрограмм плазмид MTS-pEGFP-N1 и MTS-pERFP-N1 с 1 микролитром BamH1 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов.

Затем добавьте 1 микролитр щелочной фосфатазы кишечника теленка и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После того, как продукты пищеварения были помещены в 1%-ный агарозный гель и очищена ДНК, как только что описано, запустите реакцию лигирования с использованием реагентов, перечисленных в текстовом протоколе. Затем инкубируйте реакцию при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи.

Трансформируйте компетентные клетки e. coli dH5-альфа с помощью 10 микролитров смеси для лигирования. И вырастите бактерии на пластинах LB агара плюс 10 миллиграммов на миллилитр канамицина при 37 градусах Цельсия за ночь.

На следующий день используйте стерильный наконечник для пипетки, чтобы выбрать колонию из тарелки. И вставьте наконечник в пробирку, содержащую 5 миллилитров LB канамицина. Инкубируйте культуру в течение ночи, а на следующее утро используйте мини-набор для подготовки в соответствии с текстовым протоколом, чтобы изолировать плазмиду.

Для трансфекции экспоненциально растущих клеток MCF-10A используют плазмиды Cdk1 или циклинB-1 для получения реагента для трансфекции плазмид в соотношении 1:2 на 100 мкл сыворотки и среды, не содержащей антибиотиков. Трансфектируйте клетки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. Окрашиваем и визуализируем митохондрии согласно текстовому протоколу.

Для проведения сортировки клеток необходимо трансфектировать 2 раза по 10 до 5-х клеток с нужными векторами в 6-луночный планшет с использованием соотношения ДНК и трансфекционного реагента 1:2, приготовленного в 2,5 миллилитрах сыворотки и среды, не содержащей антибиотиков. После инкубации трансфекции в течение 48 часов используйте проточную цитометрию для живой сортировки клеток, стабильно экспрессирующих GFP-меченые белки Cdk-1 и RFP-меченные белки clyclinB1 в соответствии с текстовым протоколом. Для измерения длины клеточного цикла с помощью метода проточной цитометрии EdU затравку сортировали клетки в 6-луночных планшетах с плотностью от 2,5 умножить до 10 до 5-й клетки на лунку.

После ночной инкубации добавьте EdU в питательную среду в конечной концентрации 25 микромоляров и инкубируйте еще час. Затем с интервалом в два часа используйте 1% BSA в 500 микролитрах PBS, чтобы промыть одну лунку клеток. И собрать в 1,5-миллилитровую трубку.

Центрифугируйте клетки при 350 г в течение 5 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость. Вытесните гранулу, добавив 100 микролитров фиксирующего раствора.

Хорошо перемешать и выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем используйте 1 миллилитр 1% BSA в PBS для трех промывки клеток. Затем используйте 0,5 миллилитра 70% этанола, чтобы зафиксировать ячейки при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.

При выполнении мечения EdU клетками, трансфицированными белками, меченными GFP и RFP, крайне важно погасить флуоресцентные сигналы от GFP и RFP. Чтобы добиться этого, мы добавляем дополнительный этап ночного закрепления ячеек с использованием 70% этанола. На следующий день, после промывания и пермеабилизации клеток согласно текстовому протоколу, добавьте в каждую пробирку по 0,5 миллилитра реакционного коктейля и хорошо перемешайте.

После инкубации в темноте и еще одной промывки используйте 50 микрограммов на миллилитр йодида пропидиума или PI в 1% BSA PBS для окрашивания ДНК. Проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии, чтобы проследить популяцию EdU-положительной. Представьте рассеянную точечную диаграмму меченых EdU клеток, окрашенных по содержанию ДНК и EdU.

Используйте канал APC для Alexa 647 EdU, используя 30-полосовой фильтр 670 со всем присутствующим светом, менее 685 нанометров попадающим на этот фильтр, и фикоэритриновый канал для PI с 15-полосовым фильтром 581 перед ним, со всем присутствующим светом менее 600 нанометров, попадающим на этот фильтр. С помощью стандартной стратегии стробирования для приобретения построите график площади FSC по площади SSC для морфологии, а затем PI с помощью Alexa 647 EdU для окрашивания клеток. Записывайте данные для всех пробирок одну за другой, получая 10 000 событий на образец.

На этом рисунке в качестве маркеров субмитохондриальной локализации были использованы белок митохондриального матрикса Hsp60 и белок межмембранного пространства Timm13. Аналогично Hsp60, но в отличие от Timm13, циклинB1 и Cdk1 были защищены от переваривания трипсина, что указывает на их локализацию в митохондриальном матриксе. Как показано на рисунке, с помощью вестерн-блоттинга выделенных митохондриальных фракций с использованием MTS и GFP-меченых конструкций cyclinB1 и Cdk-1 в митохондриях была достигнута сверхэкспрессия циклинаB1 и/или Cdk-1.

С помощью анализа пульса EdU было продемонстрировано, что меченые клетки S-фазы прогрессировали через фазу G2M и появлялись в фазе G1 всего за 4 часа в клетках, экспрессирующих митохондриальный циклин дикого типа B1 Cdk-1. По сравнению с 6 часами, в клетках, трансфицированных векторным контролем или мутантным циклином B1 Cdk-1, что указывает на то, что усиление митохондриального циклина B1 Cdk-1 ускоряет прогрессирование клеточного цикла. После этой процедуры можно измерить другие методы, такие как митохондриальная генерация АТФ, потребление кислорода, мембранный потенциал и активные формы кислорода, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как митохондриальная локализация киназы клеточного цикла Cdk-1 изменяет митохондриальное дыхание и выработку энергии.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать митохондриальную локализацию и митохондриальные специфические функции ядерной киназы.