Визуализация репликации ДНК в позвоночных DT40 Модель системы с использованием техники ДНК-волоконной

Общая цель данной процедуры — визуализировать репликацию ДНК на уровне отдельных молекул. Начните с включения галогенированных аналогов нуклеотидов в синтезируемую ДНК. В живых клетках нанесите клетки с меченой ДНК на предметное стекло микроскопа.

Затем нанесите клетки на предметное стекло и растяните нити ДНК по поверхности стекла. Последующее иммуноокрашивание волокон ДНК и анализ изображений, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии, позволяют изучить общую динамику репликационных вилок для количественного анализа параметров, влияющих на общую программу репликации. За последние годы были разработаны различные модификации метода флуоресцентного мечения волокон ДНК для визуализации движения отдельных репликационных вилок в живых клетках.

Данный эксперимент in vivo на клетках DT 40, который вы сейчас увидите, можно провести в течение одного дня; для этого потребуется только стандартное лабораторное оборудование и флуоресцентный микроскоп. Процедуру продемонстрирует доктор Ребекка Шваб, постдок моей лаборатории. Для маркировки клеток DT 40 in vivo используйте культуру в фазе экспоненциального роста. Добавьте маркер IDU до конечной концентрации 25 µM и перемешайте клеточную суспензию.

Инкубируйте клетки в течение 20 минут при 38 °C и 5% CO2. Затем добавьте метку CLDU до конечной концентрации 250 µM. Перемешайте и инкубируйте клеточную суспензию.

Теперь промойте клетки DT 40 ледяным раствором PBS. Ресуспендируйте осадок клеток в холодном PBS и держите маркированные клетки на льду. Нанесите две µL клеточной суспензии на один конец предметного стекла и высушите на воздухе до значительного уменьшения объема капли, но не до полного высыхания.

Теперь добавьте семь µL раствора для лизиса волокон поверх суспензии клеток и аккуратно перемешайте растворы, помешивая наконечником пипетки, затем инкубируйте в течение двух минут. Далее наклоните предметные стекла под углом 15 градусов, чтобы волокна распределились по поверхности стекла. Как только раствор с волокнами достигнет нижнего края стекла, положите его горизонтально для высушивания на воздухе.

На данном этапе вдоль предметного стекла должна появиться тонкая непрозрачная линия. Отметьте карандашом начало растянутых волокон. Сначала погрузите стекла в смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 на 10 минут.

Промойте предметные стекла в дистиллированной воде, затем погрузите их в 2,5 молярную соляную кислоту на 80 минут. Промойте стекла трижды в PBS по пять минут. Удалите излишки PBS с помощью бумажного полотенца.

Затем расположите предметные стекла горизонтально. Теперь нанесите пипеткой 5% BSA в PBS на каждое стекло, накройте покровным стеклом и инкубируйте в течение 20 минут. Осторожно сдвиньте покровное стекло по предметному стеклу вниз.

Удалите излишки BSA с помощью бумажного полотенца. Затем внесите пипеткой 50 µL раствора первичных антител к BRDU на каждый предметное стекло.

Накройте препарат покровным стеклом и инкубируйте в увлажненной камере в течение двух часов. После снятия покровных стекол трижды промойте предметные стекла в PBS по пять минут. Нанесите 50 µL раствора вторичных антител, накройте покровными стеклами и защитите предметные стекла от света.

Затем инкубируйте в течение одного часа. Снимите покровные стекла и трижды промойте предметные стекла в PBS по пять минут. В завершение нанесите на каждое предметное стекло каплю среды для заключания Vector Shield.

Осторожно прижмите покровное стекло и удалите излишки жидкости вокруг него. С помощью бумажного полотенца зафиксируйте края покровных стекол прозрачным лаком для ногтей и высушите на воздухе. Храните предметные стекла при температуре минус 20 °C.

Нанесите каплю иммерсионного масла на предметное стекло рядом с карандашной меткой и начните поиск волокон. Сместитесь в сторону от основного пучка, чтобы найти участки, где волокна четко отделены друг от друга. В типичном эксперименте выбирайте изображения, используя только один цветовой канал, чтобы избежать систематической ошибки.

Затем сделайте примерно по 10 снимков каждого образца. Перемещайтесь по предметному стеклу, чтобы сделать разные снимки, так как одна область стекла может не обеспечить репрезентативную длину волокон или репликационных структур. Импортируйте снимки в программу для анализа изображений.

Измерьте длину 100 волокон или подсчитайте от 150 до 200 различных репликационных структур. Метод двойного мечения волокон позволяет различать разные репликационные структуры. Новосинтезированную ДНК можно визуализировать в виде линий из меченных антителами нуклеотидных аналогов.

Здесь продолжающаяся элонгация репликационной вилки представлена в виде соседних красного и зеленого сигналов. Новые события инициации можно разделить на ориджины, которые сработали во время инкубации клеток с первой меткой, и ориджины, сработавшие во время инкубации со второй меткой. Первые представлены соседними зелеными, красными и зелеными сигналами, а вторые — только зеленой линией.

События терминации проявляются в виде прилегающих друг к другу красных и зеленых сигналов. Красные сигналы перемежаются. Области происхождения состоят из последовательных точек начала репликации и сигналов терминации.

В зависимости от дизайна эксперимента, остановленные или коллапсировавшие вилки могут быть определены либо как сигнал только красного цвета, либо как красная линия, за которой следует короткий зеленый участок. В данном эксперименте клетки DT 40 дикого типа имеют среднюю скорость вилки 0,4 microns per minute. При этом 63% составляют активные вилки, 10% — точки начала репликации, 16% — остановленные вилки, 8% — терминации и 3% — перемежающиеся волокна.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать и анализировать динамику репликационных вилок в клетках DT 40. Это предоставит вам необходимый инструмент для исследования дефектов репликации ДНК.