Визуализация репликации ДНК в позвоночных DT40 Модель системы с использованием техники ДНК-волоконной

Общая цель этой процедуры — визуализировать репликацию ДНК на уровне одной молекулы. Начните с включения галогенированных аналогов нуклеотидов во вновь синтезированную ДНК. В живых клетках обнаруживают клетки с меченой ДНК на микроскопе.

Затем на предметное стекло ложатся клетки и вытягивается ДНК на предметное стекло микроскопа. Последующее иммуноокрашивание волокон ДНК и анализ изображений флуоресцентной микроскопии могут пролить свет на глобальную динамику репликационной вилки, что позволит провести количественный анализ параметров, влияющих на общую программу репликации. За последние годы были разработаны различные варианты методов флюорографии ДНК-волокон для визуализации движения отдельной репликационной вилки в живых клетках.

Этот эксперимент in vivo на клетках DT 40, который вы сейчас увидите, может быть завершен в течение дня и требует только общего лабораторного оборудования и флуоресцентного микроскопа, демонстрирующего процедуру, будет доктор Ребекка Шваб, постдок в моей лаборатории. Чтобы маркировать клетки DT 40 in vivo, начните с экспоненциально растущей культуры. Добавьте этикетку IDU до конечной концентрации 25 микромоль и перемешайте клеточную суспензию.

Хорошо инкубируйте клетки в течение 20 минут при температуре 38 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Далее добавьте этикетку CLDU до конечной концентрации 250 микромоляров. Перемешайте и инкубируйте клеточную суспензию.

Теперь промойте ячейки DT 40 с помощью ледяного PBS reus. Суспензируйте клеточные гранулы в холодном PBS и держите помеченные клетки на льду. Нанесите два микролитра суспензии на один конец стекла, высушите на воздухе до тех пор, пока объем капли сильно не уменьшится, но не полностью высушите.

Теперь добавьте семь микролитров раствора лизиса клетчатки поверх клеточной суспензии и аккуратно перемешайте растворы, помешивая наконечником пипетки, инкубируйте в течение двух минут. Затем наклоните горки на 15 градусов, чтобы волокна распределились по горке. Как только раствор волокна достигнет дна предметного стекла, поместите его горизонтально для сушки на воздухе.

В этом месте вдоль предметного стекла должна быть видна тонкая непрозрачная линия. Отметьте начало растянутых волокон карандашом. Сначала погрузите горки в три к одному метанолу в уксусную кислоту на 10 минут.

Вымойте горки в дистиллированной воде, затем погрузите в 2,5 молярной соляной кислоты на 80 минут. Вымойте слайды три раза в PBS в течение пяти минут промокайте. Соберите излишки PBS на бумажное полотенце.

Затем расположите горки горизонтально. Теперь внесите пипетку 5%-ной БСА в PBS на верхнюю часть каждого предметного стекла и поместите крышку и инкубируйте в течение 20 минут. Осторожно сдвиньте крышку вниз по предметному стеклу.

Удалите излишки БСА бумажным полотенцем. Затем пипеткой нанесите 50 микролитров раствора первичного антитела против BRDU. На каждый слайд.

Накройте дичь крышкой и высиживайте во влажной камере в течение двух часов. После снятия чехлов промойте слайды трижды в PBS в течение пяти минут. Нанесите 50 микролитров раствора вторичного антитела для позиционирования крышек стекла, а также защитите предметные стекла от света.

Затем выдерживают в течение одного часа. Снимите крышки и промойте слайды три раза в PBS в течение пяти минут. Наконец, добавьте каплю монтажного материала для векторного щита на каждый слайд.

Аккуратно надавите на крышку и удалите лишнюю жидкость вокруг нее. Бумажным полотенцем заклейте чехлы прозрачным лаком для ногтей и высушите на воздухе. Храните предметные стекла при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Нанесите каплю иммерсионного масла на предметное стекло рядом с карандашной отметкой и начните искать волокна. Отойдите от основного пучка, чтобы найти участки, где волокна четко отделены друг от друга. В обычном эксперименте выбирайте изображения только с использованием одного цветового канала, чтобы избежать смещения.

Затем сделайте примерно 10 снимков каждого образца. Двигайтесь вдоль слайда, чтобы сделать разные снимки, так как одна область слайда может не обеспечивать репрезентативную длину волокон или репликационные структуры. Импортируйте снимки в программу анализа изображений.

Измерьте длину 100 волоконных трактов и/или подсчитайте от 150 до 200 различных репликационных структур. Метод двойного мечения волокон позволяет различать различные структуры репликации. Вновь реплицированная ДНК может быть визуализирована в виде линий нуклеотидов, меченных антителами.

Здесь продолжающаяся удлиняющаяся вилка представлена в виде смежных красных и зеленых сигналов. Новые события инициации можно разделить на источники, которые сработали во время инкубации клеток с первой меткой, и источники, которые сработали во время инкубации со второй меткой. Первый состоит из соседних зеленых, красных зеленых сигналов, а второй — из зеленой линии. Только.

События завершения отображаются в виде примыкающего к нему красного и зеленого цвета. Вкраплены красные сигналы. Источники состоят из последовательных исходных и завершающих сигналов.

В зависимости от экспериментального плана, заглохшие или свернутые вилки могут быть определены либо как красный сигнал, либо как красная линия, за которой следует короткий зеленый участок. В этом эксперименте ячейки дикого типа DT 40 имеют среднюю скорость вилки 0,4 мкм в минуту. С 63% текущих форков, 10% истоков, 16% застопорившихся форков, 8% окончаний и 3% вкрапленных волокон.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать и анализировать динамику репликационной вилки в ячейках DT 40. Это предоставит вам важный инструмент для исследования дефектов репликации ДНК.