Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений
5 мая 2023 г.
Описана процедура изучения динамики метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках с использованием формата многолуночного планшета и автоматизированной иммунофлуоресцентной визуализации для обнаружения и количественной оценки синтеза и распределения мтДНК. Это может быть дополнительно использовано для исследования влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК.
Протокол направлен на выявление белков с дисфункцией, приводящей к изменению количества молекул митохондриальной ДНК. Это исследование может также выявить факторы, связанные с распределением митохондриальной ДНК в митохондриях. Механизмы репликации и поддержания митохондрий до сих пор до конца не изучены.
Гораздо меньше известно о регулировании распределения митохондриальных геномов внутри органоидов и белков, участвующих в нем. В результате выявление и характеристика некоторых новых игроков будет иметь большое значение. Основным преимуществом метода является его высокая пропускная способность и протокол с высоким содержанием.
Мы можем одновременно тестировать множество экспериментальных условий и измерять различные параметры в течение одного эксперимента. В полногеномных исследованиях предлагаемый протокол дает возможность обрисовать глобальную картину того, как ядерно-кодируемая генетическая информация регулирует свой митохондриальный аналог. Кроме того, он может идентифицировать белки, дисфункция которых вызывает стресс митохондриальной ДНК и активирует путь ответа на интерферон.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается высокопроизводительный протокол изучения метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках. Метод основан на автоматизированном иммунофлуоресцентном имиджинге для детекции и количественного анализа синтеза и распределения мтДНК, что позволяет исследовать влияние ингибиторов, клеточного стресса и сайленсинга генов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Митохондриальная динамика
Теоретические сведения
- Механизмы репликации и поддержания митохондриальной ДНК изучены не полностью.
- Распределение митохондриальной ДНК внутри органелл охарактеризовано недостаточно.
- Идентификация белков, участвующих в распределении мтДНК, имеет решающее значение для понимания функций митохондрий.
- Высокопроизводительные методы могут расширить возможности изучения динамики мтДНК.
Цель исследования
- Изучение динамики метаболизма мтДНК в клетках.
- Исследование влияния различных клеточных условий на синтез и распределение мтДНК.
- Идентификация новых белков, участвующих в регуляции мтДНК.
Используемые методы
- Формат многолуночных планшетов для высокопроизводительного анализа.
- Автоматизированная иммунофлуоресцентная визуализация для количественного определения.
- Применение ингибиторов и методов сайленсинга генов.
- Оценка влияния клеточного стресса на метаболизм мтДНК.
Основные результаты
- Идентификация белков, влияющих на количество молекул мтДНК.
- Понимание факторов, воздействующих на распределение мтДНК внутри митохондрий.
- Демонстрация эффективности протокола в высокопроизводительном анализе.
- Выявление потенциальных новых регуляторов мтДНК.
Выводы
- Разработанный протокол представляет собой надежную основу для изучения динамики мтДНК.
- Понимание метаболизма мтДНК может раскрыть важные клеточные механизмы.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для дальнейшего изучения функций митохондрий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительный количественный анализ синтеза и распределения митохондриальной ДНК (мтДНК) на основе анализа изображений позволяет систематически исследовать поддержание митохондриального генома при различных воздействиях. Данная возможность имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах программ по поиску мишеней, направленных на митохондриальную функцию, а также для выяснения механического влияния сайленсинга генов или воздействия соединений на клеточную биоэнергетику. Этот подход обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней и служит основой для принятия взвешенных с учетом рисков решений по формированию портфеля исследований в контексте соответствующих заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональную оценку ядерно-кодируемых регуляторов репликации и распределения мтДНК.
- Способствует идентификации белков, дисфункция которых вызывает стрессовые ответы митохондриальной ДНК.
- Облегчает механистическую оценку рисков путем количественного определения прямого воздействия на целостность митохондриального генома.
- Предоставляет высокосодержательные данные для приоритизации мишеней, имеющих значение для митохондрий.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели синтеза и распределения мтДНК для стандартизации анализа.
- Поддерживает высокопроизводительный скрининг нокдаунов генов или малых молекул, влияющих на функцию митохондрий.
- Обеспечивает воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы с использованием многолуночных форматов и автоматизированной визуализации.
- Подготавливает стабильные биологические системы для последующей оценки соединений и фенотипического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит показатели поддержания митохондриального генома в соответствие с клеточными моделями, релевантными конкретным заболеваниям.
- Обеспечивает преемственность процесса — от первоначального обнаружения до доклинической валидации митохондриальных мишеней.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров путем установления связи между динамикой mtDNA и функциональными результатами.
- Способствует продвижению митохондриальных модуляторов в разработке с учетом оценки рисков.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод интегрируется в процесс от первичного поиска до доклинических исследований, обеспечивая количественную высокопроизводительную оценку поддержания митохондриального генома в клеточных моделях.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о ядерно-митохондриальных взаимодействиях и уточнение сигнальных путей.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные для оценки готовности анализа и сортировки соединений.
- Аналитика: обеспечивает измерения на основе флуоресценции для сравнения условий сайленсинга генов, воздействия ингибиторов или стрессовых факторов.
- Трансляционные исследования: связывает показатели митохондриальной ДНК с фенотипами, имеющими значение для заболевания, при условии соответствующего выбора модели.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемую платформу с высоким содержанием данных, адаптируемую к различным генетическим или фармакологическим воздействиям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации митохондриальных мишеней и снижает механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: Стандартизирует и масштабирует количественный анализ мтДНК для множества экспериментальных условий.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает основу для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления митохондриальных рисков.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию митохондриальных мишеней и методов вмешательства с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области высокопроизводительного имиджинга и количественного анализа флуоресценции.
- Необходимы автоматизированные платформы микроскопии и надежное программное обеспечение для анализа изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов культивирования клеток, маркировки и анализа.
- Метод adaptable к различным клеточным линиям и генетическим модификациям при условии оптимизации протокола.
- Результаты зависят от использования валидированных антител и красителей для обеспечения специфичности и воспроизводимости.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:21
Preparation of siRNA Mixture for Mitochondrial DNA Synthesis
2:00
Cell Transfection and 5‐Bromo‐2’‐Deoxyuridine (BrdU) Incorporation in HeLa Cells
3:14
5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells
4:51
HeLa Cell Fixation with Hoechst 33342 and Blocking
5:51
Addition of Primary and Secondary Antibodies to the Transfected HeLa Cells to Monitor the mtDNA Distribution
7:49
Quantitative Image Analysis to Measure the mtDNA and Gene Expression Levels in the Transfected HeLa Cells
