Иммунофлуоресцентного Обнаружение два аналога тимидина (CldU и ПИН) в первичных тканей
7 декабря 2010 г.
Мы вывели стратегии для обнаружения последовательного включения тимидина аналогов (CldU и ПИН) в тканях взрослых мышей количественно двух последовательных раундов деления клеток. Эта стратегия полезна для обнаружения обновления клеток долгоживущих тканей, онкогенных трансформации, или транзит-усилительных элементов.
Здравствуйте и добро пожаловать к протоколу окрашивания методом Calor D-U-I-D-U. Сегодня наше видео начнется с третьего этапа: регидратации, пермеабилизации и восстановления антигенов. Начните с помещения предметных стекол в кассету.
После загрузки предметных стекол поместите их в ксилоловую ванночку на пять минут. Затем следует вторая ксилоловая ванночка. Снова на пять минут.
Продолжайте регидратацию срезов, перенося их в растворы этанола, начиная со 100% раствора и заканчивая 50%. Завершите регидратацию срезов, поместив их на пять минут в 1X PBS для пермеабилизации клеточных мембран. Погрузите срезы в 0,2% раствор Triton X на пять минут. Подготовьте срезы к микроволновой демаскировке антигенов, поместив их в стеклянный стакан с достаточным объемом 0,01 молярного натрий-цитратного буфера, чтобы раствор покрывал верхний край срезов на пять сантиметров.
Чтобы компенсировать потери при испарении, подвергайте предметные стекла воздействию микроволнового излучения до закипания раствора. Это должно занять от 3 до 10 минут при полной мощности. Убедитесь, что растворы на предметных стеклах кипят.
Снизьте мощность микроволнового излучения до уровня от 10 до 80% и продолжайте медленно кипятить предметные стекла в течение еще 20 минут. После кипячения поместите стакан с предметными стеклами на лабораторный стол, чтобы они медленно остыли в течение примерно двух часов до достижения комнатной температуры. Убедитесь, что предметные стекла достигли комнатной температуры.
Погрузите предметные стекла в 1,5% раствор натуральной соляной кислоты на 40 минут при комнатной температуре. Извлеките стекла из соляной кислоты и поместите их на пять минут в 1X PBS для промывки. Затем проведите вторую промывку в 1X PBS.
Извлеките предметные стекла из раствора 1×PBS с помощью жидкого воскового карандаша для блокировки. Обведите каждый срез ткани кругом и поместите стекло обратно в PBS. Создайте увлажненную инкубационную камеру, поместив влажное бумажное полотенце на дно герметичного контейнера.
Приготовьте блокирующий раствор из 10% сыворотки для блокировки, разведенной в 1XPBS. Важно полностью покрыть каждый срез ткани раствором; для типичных срезов размером примерно 1×1,5 см достаточно объема блокирующего раствора 50 µL.
Приготовьте первичные антитела к IDU, разводя мышиную антисыворотку к BRDU в 5% сыворотке осла. Используйте разведение от 1:1 до 1:250. Нанесите полученный первичный раствор пипеткой на каждый срез на предметном стекле.
Поместите предметные стекла в холодильник при температуре 4 °C. Для инкубации в течение ночи подготовьте промывочный раствор с высокой строгойстью. Хорошо подходит TBST.
Расположите слайды друг к другу背面. Поместите слайды примерно в 35–40 миллилитров раствора TBST. Поместите пробирки в шейкер-инкубатор для бактериальных культур при температуре 37 °C.
Инкубируйте образцы при перемешивании в течение 20 минут со скоростью 225 RPM. Затем поместите предметные стекла в кассету. Поместите стекла в XPBS для промывки в PBS в течение пяти минут.
Затем следует провести второе промывание в XPBS в течение пяти минут. Приготовьте раствор первичных антител к CLDU, разводя антитела крысы к BRDU в 5% сыворотке осла. Добавьте в концентрации от 1:250, поместите предметные стекла на бумажное полотенце, а затем проведите разметку восковым карандашом.
С помощью пипетки нанесите первичный раствор CLDU на каждый срез ткани. Используйте около 50 µL раствора, чтобы каждый срез ткани был полностью покрыт. Поместите предметные стекла в холодильник при температуре 4 °C для инкубации в течение ночи.
Поместите предметные стекла в кассету, затем перенесите их в раствор 1X PBS для промывки на пять минут. Перенесите стекла во второй раствор 1X PBS для промывки еще на пять минут. Подготовьте вторичные антитела, разводя антитела CY two donkey anti RAD и PS five donkey anti muse в 5% сыворотке осла. Для окрашивания ядер также будет использован DPI. Полностью покройте срезы тканей вторичными антителами.
50 µL растворов должно быть достаточно для полного покрытия ткани. Поместите камеру для регидратации в темное место при комнатной температуре для инкубации в течение одного часа. Поместите предметные стекла в кассету, а затем перенесите их для одного промывания в XPBS на пять минут.
Поместите стекла для повторной промывки в 1xPBS на пять минут. Удалите излишки раствора PBS с помощью бумажного полотенца. Затем возьмите Prolong Gold антифейдинговыйmounting-реагент и нанесите одну небольшую каплю на каждый срез ткани.
Возьмите покровное стекло и осторожно поместите его поверх срезов на предметном стекле. Используйте бумажное полотенце в качестве пресса, чтобы вытеснить любые лишние пузырьки воздуха, которые могли оказаться между срезами и покровным стеклом. В завершение с помощью наконечника пипетки удалите оставшиеся пузырьки воздуха. Снимите изображение интересующей вас ткани с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного источником света высокой энергии и несколькими флуоресцентными каналами, для количественной оценки результатов.
Начните с подсчета количества Dabi-положительных клеток. Подсчитайте количество CLDU-положительных клеток, используя двухканальное изображение SI. Подсчитайте количество IDU-положительных клеток, используя пятиканальное изображение SCI.
Наконец, подсчитайте количество дважды положительно меченных клеток, переключаясь между файлами изображений каналов SCI two и SCI five.
Обзор
В данной статье представлен метод детекции последовательного включения аналогов тимидина (CldU и IdU) в ткани взрослых мышей, позволяющий количественно оценить два последовательных раунда клеточного деления. Этот метод представляет ценность для изучения обновления клеток в долгоживущих тканях, онкогенной трансформации и транзитно-амплифицирующих клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Нейробиология
- Онкология
Теоретические сведения
- Аналоги тимидина используются для маркировки делящихся клеток.
- Понимание процессов клеточного деления имеет решающее значение для изучения регенерации тканей.
- Обновление клеточного состава важно как при нормальной физиологии, так и при патологических состояниях.
- Последовательное маркирование позволяет получить представление о динамике клеточных популяций.
Цель исследования
- Разработать надежный метод количественной оценки деления клеток в тканях.
- Оценить значение обновления клеток в различных биологических контекстах.
- Углубить понимание онкогенных процессов посредством анализа деления клеток.
Используемые методы
- Последовательное введение CldU и IdU в ткани мыши.
- Флуоресцентная микроскопия для визуализации меченых клеток.
- Количественный анализ DAB-, CldU- и IdU-положительных клеток.
- Использование специфических антител для детекции аналогов тимидина.
Основные результаты
- Успешное выявление последовательного деления клеток в образцах тканей.
- Количественный анализ скорости обновления клеток.
- Идентификация потенциальных маркеров онкогенной трансформации.
- Представление о поведении транзитно-амплифицирующих клеток.
Выводы
- Разработанный метод представляет собой надежный подход к изучению деления клеток.
- Полученные результаты способствуют пониманию динамики тканей в норме и при патологии.
- Данный метод может быть применен в различных областях исследований, включая онкологию и регенеративную медицину.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Точный количественный анализ последовательного деления клеток позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней, проясняя динамику пролиферации в системах, релевантных для конкретных заболеваний. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, позволяя отличить преходящий пролиферативный ответ от устойчивого, что дает важную информацию для идентификации перспективных соединений-лидеров и приоритизации портфеля разработок. Применимость данного метода к долгоживущим тканям расширяет возможности поиска трансляционных биомаркеров в онкологии и регенеративной медицине.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения двух последовательных раундов деления клеток в первичной ткани.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени посредством прямой визуализации кинетики пролиферации в моделях заболеваний.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению механистических рисков путем количественного определения скорости обновления клеток, что позволяет оценить достоверность мишени и модуляцию сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных биологических систем для последующей оценки соединений с помощью стандартизированных протоколов иммуноокрашивания.
- Количественные показатели: Получение измеримых показателей количества DAB-, CldU- и IdU-положительных клеток для воспроизводимых конечных точек скрининга.
- Масштабируемость: Оптимизация для введения низких доз аналогов тимидина с питьевой водой, что позволяет проводить исследования хронического дозирования на доклинических моделях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Применяется для выявления онкогенной трансформации и оценки вклада транзитно-амплифицирующих клеток в рост ткани.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от этапа открытия к доклинической валидации, предоставляя количественные данные о пролиферации в различных типах тканей.
- Решения с учетом рисков: Помогает в разработке стратегий дальнейшего развития, уточняя, вызван ли наблюдаемый рост активностью стволовых клеток или экспансией транзитно-амплифицирующих клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до оценки доклинической эффективности, предоставляя показатели пролиферации, которые служат основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработок на каждом этапе.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез путем количественной оценки последовательного синтеза ДНК в ответ на фармакологические или генетические воздействия.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу срезы тканей со стандартизированным определением включения аналогов тимидина для скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет сравнивать индексы пролиферации в различных условиях за счет разделения флуоресцентных каналов и количественного определения дважды положительных клеток.
- Трансляционные исследования: Связывает этап ранних открытий с доклинической валидацией путем отслеживания динамики клеточных линий в тканях, имеющих значение для заболеваний человека.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для лонгитюдных исследований пролиферации в различных терапевтических областях.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней, предоставляя прямые доказательства истории деления клеток.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных рабочих процессов пермеабилизации, демаскировки антигенов и мультиплексного иммуноокрашивания.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски, связанные с мишенями, за счет оценки пролиферативной нагрузки.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, разграничивая терапевтические эффекты в популяциях стволовых клеток и клеток-предшественников.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии для мультиплексного детектирования.
- Зависимость от наличия инфраструктуры для демаскировки антигенов (микроволновая печь, цитратный буфер) и возможности проведения последовательной инкубации с антителами.
- Необходима стандартизация протоколов блокировки, промывки и заключения препаратов между исследовательскими группами для минимизации пакетных эффектов.
- Адаптация для различных модельных систем требует подтверждения специфичности антител и проницаемости тканей в каждом конкретном случае.
- Практические ограничения включают возможную маскировку эпитопов и необходимость оптимизации графиков дозирования аналогов для предотвращения токсичности.
