Изготовление Micro-тканей с использованием модулей Коллаген гель, содержащий клетки

Общей целью этой процедуры является получение модульных микротканей, которые могут быть использованы для экспериментов по тканевой инженерии. Это достигается путем сначала втягивания коллагенового раствора в полиэтиленовую трубку с помощью шприца, а затем гелеобразования коллагена. Второй шаг заключается в разрезании полиэтиленовой трубки на два миллиметра длины для формирования микротканевых модулей.

Третьим этапом процедуры является отделение модулей от трубки, и, наконец, модули покрываются эндотелиальными клетками. В конечном счете, полученные микроткани могут быть использованы для клеточных анализов in vitro для изучения взаимодействия клеток через микрофлюидную камеру. Кроме того, микроткани могут быть имплантированы для создания тканей для изучения взаимодействия и ремоделирования микротканей in vivo.

Здравствуйте, меня зовут Брендан Лонг из лаборатории Сепан здесь, в Университете Торонто. Основным препятствием в создании большого 3D заменителя ткани является отсутствие быстрой васкуляризации после имплантации. В этом видео мы покажем вам, как создать модульную ткань, покрытую эндотелиальными клетками, чтобы помочь преодолеть это ограничение.

Демонстрацией процедуры будет считать Чемберлена, послеоперационного сотрудника из лаборатории Септина. Количество коллагена для нейтрализации будет зависеть от длины полиэтиленовой трубки. В этой демонстрации мы будем использовать двухметровую полиэтиленовую трубку с внутренним диаметром 0,76 миллиметра и внешним диаметром 1,22 миллиметра.

Чтобы подготовить трубку, проденьте иглу 20 G в один конец трубки, а затем поместите трубку в конвертерный мешочек для самовосстановления для газовой стерилизации. Так как один миллилитр коллагена заполняет около двух метров полиэтиленовой трубки, то один миллилитр коллагена мы нейтрализуем. Поместите коллаген в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и держите трубку на льду.

Добавьте в пробирку 128 микролитров 10 х альфа, МЕМ на миллилитр коллагена и перемешайте путем многократного пипетирования раствора. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму образование пузырьков, раствор должен стать желтым, когда альфа-MEM смешивается с подкисленным коллагеном. Затем нейтрализуйте коллаген, добавив 0,8 моляра бикарбоната натрия Для общей оценки pH добавляйте бикарбонат натрия до тех пор, пока желтый раствор коллагена не приобретет светло-розовый цвет.

Обычно требуется от 30 до 60 микролитров на миллилитр коллагена для достижения pH 7,4. Чтобы нейтрализованный коллаген не загустел, держите его на льду, пока он не будет готов к использованию. Чтобы начать процедуру желирования коллагена, отнесите пакет, содержащий стерилизованную полиэтиленовую трубку, в шкаф биологической безопасности и отрежьте герметичный конец пакета, сохраняя трубку в пакете.

С помощью стерилизованного пинцета прикрепите трехмиллилитровый шприц к игле 20 калибра, которая ранее была вставлена в один из концов трубки. Вставьте другой конец трубки в нейтрализованный коллаген до тех пор, пока кончик не окажется на дне конической трубки, которая удерживается на льду. Следующий шаг нужно делать медленно, иначе вы вводите пузырьки воздуха в коллаген.

Медленно втяните поршень шприца, чтобы втянуть коллаген в полиэтиленовую трубку. Когда коллаген будет протянут через трубку, вытащите иглу 20 калибра и вставьте оба конца трубки обратно в мешок. После заклеивания пакета заклеивают скотчем, выдерживают при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут.

Для резки трубки будет использоваться предварительно собранное режущее устройство. Чтобы начать эту процедуру, поместите трубку в стерильный лоток перед режущим устройством и загрузите трубку в режущее устройство на выходе из режущего устройства, установите коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 25 миллилитров эндотелиальных клеточных сред. Чтобы собрать отрезанные модули, настройте режущее устройство на отрезание трубки длиной два миллиметра, а затем разрежьте трубку.

Инкубируйте отрезанные модули в конической пробирке объемом 50 миллилитров при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. Для удаления коллагеновых модулей из трубки, вортекса, 50 литровой конической трубки, содержащей модули, со средней скоростью. В течение 10 секунд дайте модулю осесть на дно трубки, что займет около пяти минут.

Рыхлая гранула из модулей будет образовываться на дне трубки, в то время как трубка будет образовывать слой поверх среды. После того, как модули осядут, используйте широкую горлышко, 10-миллилитровую серологическую пипетку, чтобы перенести их в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Вихрь, 15 миллилитровую коническую трубку, а затем дать модулям отстояться еще два раза.

Осевшие модули из второго и третьего вихря также переносятся в 15-миллилитровую трубку. После того как все модули будут извлечены из трубки и собраны, доведите объем среды в трубке до пяти миллилитров. Теперь модули готовы к покрытию эндотелиальными клетками, которое будет показано далее для подготовки эндотелиальных клеток к покрытию модулей.

Сначала удалите фильтрующий материал из ячеек и промойте PBS. После удаления PBS добавьте три миллилитра трипсина ЭДТА и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее ресусзируйте, подвесьте клетки в семи миллилитрах среды и переложите в 15-миллилитровую трубку.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, вам понадобится пять раз по 10 до шестого эндотелиальных клеток на миллилитр упакованных модулей на дне конической трубки. Гранулируйте ячейки по 300 г в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах эндотелиальной клеточной среды.

Теперь добавьте в модули пять миллилитров среды, содержащей эндотелиальные клетки. Модули инкубируют с эндотелиальными клетками, как статически, так и динамически для статической инкубации, смешивают модули с эндотелиальными клетками путем инверсии, а затем устанавливают трубку в вертикальное положение при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Через 15 минут снова переверните трубку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия еще 15 минут.

Чтобы динамически инкубировать модули с эндотелиальными клетками, осторожно покачивайте 15-миллилитровую трубку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. После завершения инкубации с эндотелиальными клетками перенесите модули в планшет, не обработанный тканевой культурой, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день, поместите модули в новую планшет, не обработанную тканевой культурой, со свежей средой для удаления неприкрепленных эндотелиальных клеток. Инкубируйте модули, покрытые эндотелиальными клетками, при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока клетки не покроют 100% поверхности модулей.

Обычно на это уходит около семи дней. Модули будут выглядеть цилиндрическими при первом извлечении из трубы. Если они покрыты эндотелиальными клетками, они могут сокращаться до 50% в объеме и приобретать овальную форму, а также становиться более плотными и непрозрачными при рассмотрении с помощью световой микроскопии.

На этих изображениях диаметр и длина модулей обозначены как d и l соответственно. На следующем изображении показаны два встроенных ячеек Hep G, равномерно распределенных внутри модулей на момент изготовления. Клетки сохранили высокую жизнеспособность, о чем свидетельствует зеленый цвет живых клеток.

Мертвые клетки будут иметь красный цвет, когда эндотелиальные клетки сливаются. На поверхности модулей происходит образование плотных соединений, которые можно увидеть с помощью иммунофлюоресценции. Анализ массопереноса VE кадгерина показал, что модули способны поддерживать высокую плотность клеток без развития некротического ядра из-за недостаточного транспорта кислорода, что часто проблематично в более крупных тканях.

В этом примере массовое три-хромоокрашивание типичных малых модулей показывает, что модули сохранили равномерное и высокое распределение живых клеток через семь дней после изготовления. Напротив, в ядре больших модулей образовалось большое количество мертвых клеток, оставив только тонкий ободок жизнеспособных клеток. Модули также были изготовлены из смеси коллагена и полимера, содержащего микросферы, элюирующие лекарственные средства.

При этом, когда клетки EC one сидят на модулях палинового коллагена, модули сохраняют свою цилиндрическую форму и имеют ограниченные свойства прикрепления клеток по сравнению с модулями, состоящими только из коллагена. Здесь показано изображение с помощью светового микроскопа коллагенового модуля, содержащего биоразлагаемые микросферы на основе PLGA. Было показано, что несколько анализов in vitro совместимы с модулями.

Например, в анализе ангиогенеза капилляроподобные образования на модуле, сидящем на эндотелиальных клетках, могут быть легко обнаружены и количественно оценены после пяти дней инкубации со стволовыми клетками, полученными из жировой ткани. В другом примере конфокальные микроскопические изображения анализа живых мертвецов на модулях показывают живые клетки, окрашенные в зеленый цвет, и мертвые клетки, окрашенные в красный. Наконец, модули также использовались в микрофлюидных камерах и имплантировались мышам и крысам для изучения взаимодействия между различными типами клеток и того, как микроткани ремоделируются реакцией хозяина.

После процедуры модули могут быть культивированы в чашке Петри или других сосудах, таких как биореактор или микрофлюидное устройство. Этот метод также может быть адаптирован для создания различных тканей с использованием различных комбинаций типов клеток или с использованием трубок разного диаметра. Спасибо за просмотр.