Изготовление Micro-тканей с использованием модулей Коллаген гель, содержащий клетки

Общая цель данной процедуры — создание модульных микротканей, которые могут быть использованы в экспериментах по тканевой инженерии. Это достигается путем первоначального введения раствора коллагена в полиэтиленовую трубку с помощью шприца с последующим гелеобразованием коллагена. На втором этапе полиэтиленовую трубку разрезают на отрезки длиной два миллиметра для формирования модулей микроткани.

Третьим этапом процедуры является отделение модулей от трубок, и, наконец, модули покрываются эндотелиальными клетками. В итоге полученные микроткани можно использовать для проведения клеточных анализов in vitro с целью изучения взаимодействия клеток с помощью микрофлюидной камеры. Кроме того, микроткани могут быть имплантированы для создания тканей с целью изучения взаимодействия и ремоделирования микротканей in vivo.

Здравствуйте, меня зовут Брендан Лонг, я из лаборатории Сепана Университета Торонто. Основным препятствием при создании крупных 3D-заменителей тканей является отсутствие быстрой васкуляризации после имплантации. В этом видео мы покажем вам, как создать модульную ткань, покрытую эндотелиальными клетками, чтобы помочь преодолеть это ограничение.

Процедуру продемонстрирует Чемберлен, постдокторант из лаборатории Septin. Количество коллагена для нейтрализации будет зависеть от длины полиэтиленовой трубки. В данной демонстрации мы будем использовать полиэтиленовую трубку длиной два метра с внутренним диаметром 0.76 millimeter и внешним диаметром 1.22 millimeter.

Для подготовки трубки вставьте иглу 20 G в один конец трубки, затем поместите трубку в самозатягивающийся конверт-пакет для газовой стерилизации. Поскольку один миллилитр коллагена заполняет примерно два метра полиэтиленовой трубки, мы нейтрализуем один миллилитр коллагена. Поместите коллаген в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и держите пробирку на льду.

Добавьте в пробирку 128 µL 10x alpha-MEM на каждый миллилитр коллагена и перемешайте раствор путем многократного пипетирования. При этом следует избегать образования пузырьков; по мере смешивания alpha-MEM с подкисленным коллагеном раствор должен окраситься в желтый цвет. Затем нейтрализуйте коллаген, добавив 0,8 M бикарбонат натрия. Для приблизительной оценки pH добавляйте бикарбонат натрия до тех пор, пока желтый раствор коллагена не приобретет светло-розовый цвет.

Обычно требуется от 30 до 60 µL на миллилитр коллагена для достижения pH 7.4. Чтобы предотвратить гелеобразование нейтрализованного коллагена, храните его на льду до начала использования. Для начала процедуры гелеобразования коллагена перенесите пакет со стерилизованной полиэтиленовой трубкой в шкаф биологической безопасности и отрежьте запечатанный конец пакета, оставив трубку внутри пакета.

С помощью стерильного пинцета прикрепите шприц объемом 3 мл к игле калибра 20G, которая была предварительно вставлена в один конец трубки. Введите другой конец трубки в нейтрализованный коллаген так, чтобы наконечник оказался на дне конической пробирки, находящейся на льду. Следующий шаг необходимо выполнять медленно, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в коллаген.

Медленно потяните поршень шприца назад, чтобы перенести коллаген в полиэтиленовую трубку. Когда коллаген пройдет через трубку, извлеките иглу 20 gauge и поместите оба конца трубки обратно в пакет. Заклейте пакет скотчем и инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут.

Для разрезания трубки будет использовано предварительно собранное режущее устройство. Чтобы начать эту процедуру, поместите трубку в стерильный лоток перед режущим устройством и загрузите трубку в устройство со стороны выходного отверстия; подготовьте коническую пробирку объемом 50 milliliter, содержащую 25 milliliters среды для эндотелиальных клеток. Чтобы собрать разрезанные модули, настройте устройство на резку трубки отрезками по два millimeter, после чего разрежьте трубку.

Инкубируйте вырезанные модули в 50-миллилитровой конической пробирке при 37 °C в течение 60 минут. Чтобы извлечь коллагеновые модули из трубки, подвергните пробирку объемом 50 мл с модулями воздействию вортекса на средней скорости в течение 10 секунд. Оставьте модули оседать на дно пробирки, что занимает около пяти минут.

На дне пробирки образуется рыхлый осадок из модулей, а трубки сформируют слой на поверхности среды. После оседания модулей с помощью широкого口的 серологической пипетки объемом 10 миллилитров перенесите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Перемешайте содержимое конической пробирки объемом 15 миллилитров на вортексе, затем дайте модулям осесть еще дважды.

Осевшие модули из второго и третьего вихря также переносят в пробирку объемом 15 миллилитров. После того как все модули будут извлечены из трубок и объединены, доведите объем среды в пробирке до пяти миллилитров. Теперь модули готовы к заселению эндотелиальными клетками; в следующем разделе будет показано, как подготовить эндотелиальные клетки для заселения модулей.

Сначала удалите среду из лунок с клетками и промойте их PBS. После удаления PBS добавьте три миллилитра трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C. Затем ресуспендируйте клетки в семи миллилитрах среды и перенесите их в пробирку объемом 15 мл.

Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра; вам потребуется 5×10⁶ эндотелиальных клеток на миллилитр упакованных модулей на дне конической пробирки. Осадите клетки центрифугированием при 300 G в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточный осадок в пяти миллилитрах среды для эндотелиальных клеток.

Теперь добавьте в модули пять миллилитров среды, содержащей эндотелиальные клетки. Модули инкубируют с эндотелиальными клетками как в статическом, так и в динамическом режимах: для статической инкубации перемешайте модули с эндотелиальными клетками путем переворачивания пробирки, а затем установите ее вертикально при температуре 37 °C на 15 минут. Через 15 минут снова переверните пробирку и инкубируйте при 37 °C еще в течение 15 минут.

Для динамической инкубации модулей с эндотелиальными клетками осторожно встряхивайте пробирку объемом 15 мл при 37 °C в течение 60 минут. По завершении инкубации с эндотелиальными клетками перенесите модули в планшет, не обработанный для культивирования тканей, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. На следующий день поместите модули в новый планшет, не обработанный для культивирования тканей, со свежей средой, чтобы удалить неприкрепившиеся эндотелиальные клетки. Инкубируйте покрытые эндотелиальными клетками модули при 37 °C до тех пор, пока клетки не покроют 100% поверхности модулей.

Обычно это занимает около семи дней. Сразу после извлечения из пробирки модули будут иметь цилиндрическую форму. Если они покрыты эндотелиальными клетками, их объем может сократиться до 50%, они могут приобрести овальную форму, а также стать более плотными и менее прозрачными при рассмотрении под световым микроскопом.

На этих изображениях диаметр и длина модулей обозначены буквами d и l соответственно. Следующее изображение демонстрирует встроенные клетки Hep G two, равномерно распределенные внутри модулей в момент изготовления. Клетки сохранили высокую жизнеспособность, о чем свидетельствует зеленый цвет живых клеток.

При слиянии эндотелиальных клеток погибшие клетки будут окрашены в красный цвет. На поверхности модулей формируются плотные контакты, что можно наблюдать с помощью иммунофлуоресценции. Анализ массопереноса с окрашиванием VE-кадгерина показал, что модули способны поддерживать высокую плотность клеток без развития некротического ядра из-за недостаточного транспорта кислорода, что часто является проблемой при работе с более крупными тканями.

В данном примере многоцветное окрашивание типичных малых модулей показывает, что через семь дней после изготовления в модулях сохранилось равномерное и высокое распределение живых клеток. Напротив, в центре крупных модулей образовалось большое количество мертвых клеток, в результате чего остался лишь тонкий ободок жизнеспособных клеток. Также были созданы модули с использованием смеси коллагена и тонкого полимера или содержащие микросферы с высвобождением лекарственного вещества.

В данном случае, когда клетки hHMEC высевают на модули из чистого коллагена, модули сохраняют свою цилиндрическую форму, а свойства прикрепления клеток ограничены по сравнению с модулями, состоящими только из коллагена. Здесь представлено изображение коллагенового модуля, содержащего биоразлагаемые микросферы на основе PLGA. Было показано, что несколько анализов in vitro совместимы с данными модулями.

Например, при анализе ангиогенеза капилляроподобные структуры в модуле с эндотелиальными клетками можно легко обнаружить и количественно оценить после пяти дней инкубации со стволовыми клетками, полученными из жировой ткани. В другом примере изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии при проведении анализа жизнеспособности клеток в модулях, демонстрируют живые клетки, окрашенные в зеленый цвет, и погибшие клетки, окрашенные в красный цвет. Наконец, модули также использовались в микрофлюидных камерах и имплантировались мышам и крысам для изучения взаимодействия между различными типами клеток и того, как микроткани перестраиваются под воздействием реакции хозяина.

После завершения процедуры модули можно культивировать в чашке Петри или в других сосудах, таких как биореактор или микрофлюидное устройство. Данный метод также может быть адаптирован для создания различных тканей путем использования различных комбинаций типов клеток или трубок разного диаметра. Спасибо за внимание.