Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении Т-клеточных ответов на представляющие интерес антигены. Это достигается путем предварительного кодирования антителами захвата. Вторым этапом процедуры является добавление клеток и антигенов, представляющих интерес, а затем инкубация в течение ночи.

Третьим этапом процедуры является добавление антител к обнаружению. Завершающим этапом процедуры является проявка пластины с реагентами для подложки и анализ пятен. В конечном счете, можно получить результаты выбора интересующих цитокинов путем анализа пятнообразующих единиц.

Здравствуйте, меня зовут Dr.Ki Рихтер, и я являюсь научным сотрудником в лаборатории доктора Уандера Дрейка в Университете Вандербильта в отделении инфекционных заболеваний. Сегодня мы демонстрируем метод Ellie Spot, также известный как иммуноферментный анализ. Доктор Исфахан Чемберс и Тиффани Коун продемонстрируют вам эту технику сегодня.

С целью поддержания стандартов клеточных культур выполняйте манипуляции в стерильных условиях в капюшоне, открывайте подспотную пластину и трижды промывайтесь PBS. Приготовьте обволакивающий раствор антитела захвата в PBS. Хорошо перемешайте вортексированием для удобства.

Переведите раствор антитела в резервуар для многоканального, пипеттер и аликвоту по 100 микролитров раствора покрытия в каждую. Хорошо укупорьте тарелку перфилом и поставьте в холодильник на ночь. Эти пластины, покрытые антителами, хороши в течение нескольких недель.

Эмпирическое правило гласит, что планшет можно использовать, если в скважинах еще осталась жидкость. Чтобы подготовить клетки для этого анализа, покрасьте только что выделенные мононуклеарные клетки периферической крови синим цветом для жизнеспособности и подсчитайте их. Поместите pbmc в 2 миллиона клеток на миллилитр в нашу среду и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Чтобы отслеживать ход эксперимента, пометьте крышку точечной пластины Али идентификационным номером образца, состоянием скважины и датой.

Вымойте тарелку шесть раз стерильным PBS методом dump and blot. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгать пластину во время сброса, так как это может привести к тому, что отверстия пластины станут фиолетовыми. Добавьте 20 сред в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа.

Пока планшет инкубируется, подсчитайте клетки, которые отдохнули за ночь. Соберите pbmc методом центрифугирования. Сцеживаем надосадочную жидкость и ресуспендируем гранулу в наших 10 средах в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр.

После часовой инкубации контактной пластины удалите среду R 20 методом сброса и блоттинга. Будьте осторожны, чтобы не забрызгать тарелку во время разгрузки. Добавьте в каждую по 100 микролитров клеточной суспензии.

Хорошо следует план эксперимента с добавлением пептидов и антигенов в соответствующие тестовые лунки. Всегда включайте отрицательный контроль клеток без пептидов, а также положительные контрольные лунки с добавлением фитогемагглютинина. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Вымойте тарелку шесть раз со 150 микролитрами одного XPBS методом dump and blot. Добавьте по 100 микролитров PBS в каждую лунку тарелки и поставьте тарелку в холодильник или при комнатной температуре на 15 минут. Тем временем приготовьте раствор антител к биотину в PBS.

Достаньте точечную пластину ALI из холодильника и выбросьте PBS, бросив ее в корзину для мусора. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгать планшет во время выливания аликвоты раствора антитела биотина в каждую лунку и инкубируйте планшет в шкафу для культуры тканей при комнатной температуре в течение одного часа. Вымойте пластину шесть раз PBS методом сброса и промокания при последней стирке.

Оставьте PBS на тарелке. Приготовьте раствор антитела СТРЕПТАВИДИН в PBS, убедившись, что раствор перемешан вихрем. Хорошо отбросьте последнюю смывку PBS из лунок и нанесите на график точечную пластину ALI.

Добавьте раствор антитела стрептавидина в каждую лунку и инкубируйте планшет в вытяжке для культуры тканей при комнатной температуре в течение одного часа. Для того чтобы удалить избыток антител треваина, промывайте пластину шесть раз PBS методом сброса и блота на последней промывке, проводите PBS на пластине. Учитывая светочувствительность субстрата B-C-I-P-M-B-T щелочной фосфатазы.

Работайте в темное время суток при приготовлении стеблевого раствора, как описано производителями в инструкции к набору щелочного фосфатазного субстрата: выбросьте остатки ПБС из лунок и промокните пластину для пятна. В каждую лунку добавьте раствор субстрата и включите свет. После пяти-10 минут проявления цвета дайте реактивам оставаться на пластине до тех пор, пока пятна не начнут становиться фиолетовыми и не станут довольно темными.

Это занимает до 20 минут. Трижды промойте пятночную пластину Ali водой из-под крана и дайте высохнуть на воздухе. Каждая пластина содержит положительный контроль, отрицательный контроль и интересующий пептид, проведенный как минимум в двух экземплярах.

Положительные контрольные лунки имеют глубокий фиолетовый цвет, отражают сливающийся слой клеток и практически не имеют белого фона. Отрицательные контрольные скважины не имеют фиолетового фона и пятен, как ожидалось. Лунки тестового образца иллюстрируют здесь клеточные реакции на микробные пептиды.

Фиолетовые пятна представляют собой одну чувствительную клетку, экспрессирующую цитокин, представляющий интерес при проведении техники LA spot. Будьте осторожны, чтобы не проколоть мембрану наконечниками пипеток и не дать пластине высохнуть, так как это приведет к образованию высокого фона.