Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении Т-клеточного ответа на интересующие антигены. Сначала проводится кодирование с помощью захватывающих антител. Вторым этапом процедуры является добавление клеток и интересующих антигенов с последующей инкубацией в течение ночи.

Третьим этапом процедуры является добавление антител для детекции. Заключительным этапом процедуры является проявление планшета с помощью реагентов субстрата и анализ пятен. В итоге, путем анализа пятен, образующих колонии, можно определить интересующие цитокины.

Здравствуйте, меня зовут доктор Ки Рихтер, я научный сотрудник в лаборатории доктора Уондер Дрейк в отделении инфекционных заболеваний Университета Вандербильта. Сегодня мы демонстрируем метод ELISpot, также известный как иммуноспот-анализ с ферментативной меткой. Доктор Исфахан Чамберс и Тиффани Коун продемонстрируют вам эту методику сегодня.

Для соблюдения стандартов культивирования клеток выполняйте манипуляции в стерильных условиях в ламинарном шкафу: откройте планшет с лунками ally и трижды промойте их PBS. Приготовьте раствор для покрытия из захватывающих антител в PBS. Для удобства тщательно перемешайте раствор с помощью вортекса.

Перенесите раствор антител в резервуар для многоканального дозатора и внесите по 100 µL рабочего раствора для покрытия в каждую лунку. Герметично закройте планшет пленкой и поместите в холодильник на ночь. Такие планшеты, покрытые антителами, сохраняют свои свойства в течение нескольких недель.

Общепринятое правило гласит, что планшетом можно пользоваться до тех пор, пока в лунках остается жидкость. Чтобы подготовить клетки для данного анализа, окрасьте свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови трипановым синим для определения жизнеспособности и подсчитайте их. Расселите PBMC из расчета 2 миллионов клеток на мл в 10 мл среды и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 5% CO2. Для контроля хода эксперимента пометьте крышку планшета с идентификационным номером образца, условиями в лунках и датой.

Промойте планшет шесть раз стерильным PBS, используя метод слива и промакивания. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгать содержимое при сливе, так как это может привести к окрашиванию лунок планшета в пурпурный цвет. Добавьте по 20 µL среды в каждую лунку и инкубируйте планшет при 37 °C в течение одного часа.

Пока планшет находится в инкубаторе, подсчитайте клетки, которые выдерживались в течение ночи. Соберите PBMC путем центрифугирования. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 10 мл среды до концентрации 1 миллион клеток на мл.

После одного часа инкубации планшета с лунками удалите среду R 20 методом слива и промакивания. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгать содержимое при сливе. Добавьте по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку.

Следуйте плану эксперимента, добавляя пептиды и антигены в соответствующие тестовые лунки. Всегда включайте отрицательный контроль (клетки без пептидов), а также лунки с положительным контролем с добавлением фитогемагглютинина. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2.

Промойте планшет шесть раз 150 µL 1× PBS, используя метод слива и промакивания. Добавьте по 100 µL PBS в каждую лунку планшета и выдержите планшет в холодильнике или при комнатной температуре в течение 15 минут. Тем временем приготовьте раствор биотинилированных антител в PBS.

Достаньте планшет с образцами ALI из холодильника и удалите PBS, резко вытряхнув его в контейнер для отходов. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгать содержимое планшета; добавьте аликвоту раствора антител к биотину в каждую лунку и инкубируйте планшет в ламинарном шкафу при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте планшет с PBS шесть раз, применив метод слива и промакивания при последней промывке.

Оставьте PBS на планшете. Приготовьте раствор антител к СТРЕПТАВИДИНУ в PBS, предварительно перемешав раствор на вортексе. Слейте последнюю промывочную порцию PBS из лунок и нанесите точки ALI на планшет.

Добавьте раствор антител к стрептавидину в каждую лунку и инкубируйте планшет в ламинарном шкафу для культивирования тканей при комнатной температуре в течение одного часа. Для удаления избытка антител к стрептавидину промойте планшет шесть раз раствором PBS, используя метод слива и промакивания; при последней промывке оставьте PBS на планшете. Учитывайте светочувствительность раствора субстрата щелочной фосфатазы B-C-I-P-M-B-T.

При подготовке раствора субстрата выполняйте работу в темноте, согласно инструкциям производителя, прилагаемым к набору субстрата для щелочной фосфатазы; удалите остатки PBS из лунок и промокните планшет с точечными гибридизациями. Добавьте раствор субстрата в каждую лунку и включите свет. После 5–10 минут проявления цвета оставьте реагенты на планшете до тех пор, пока пятна не начнут приобретать пурпурный оттенок и не станут достаточно темными.

Этот процесс занимает до 20 минут. Промойте планшет Ali трижды водопроводной водой и дайте ему высохнуть на воздухе. Каждый планшет содержит положительный контроль, отрицательный контроль и исследуемый пептид, причем каждый образец ставится минимум в двух повторах.

Лунки положительного контроля имеют глубокий пурпурный цвет, что отражает наличие сплошного слоя клеток и практически полное отсутствие белого фона. Лунки отрицательного контроля, как и ожидалось, не имеют пурпурного фона и пятен. Лунки с исследуемыми образцами демонстрируют здесь клеточный ответ на микробные пептиды.

Фиолетовые пятна представляют собой отдельные реагирующие клетки, экспрессирующие интересующий цитокин при использовании метода LA-споттинга. Пожалуйста, будьте осторожны, чтобы не проколоть мембрану наконечниками пипеток и не допустить высыхания планшета, так как это приведет к высокому уровню фонового сигнала.