Дрожжи колонии Вложение Метод

Общая цель этой процедуры заключается в внедрении колоний дрожжей. Это достигается путем удаления колонии и лежащего под ним агара из агаровой пластины, помещения его на несколько капель расплавленного агара и быстрого покрытия еще большим количеством расплавленного аара. Затем излишки AER обрезаются из колонии, чтобы сделать ее достаточно маленькой, чтобы поместиться в форму.

Затем встроенная колония AER фиксируется, окрашивается, обезвоживается и, наконец, инфильтрируется смолой шпор. Затем блок помещают в форму с дополнительными шпорами, смолу инкубируют до затвердевания, а затем разрезают. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие распределение типов клеток в колонии дрожжей с помощью световой или электронной микроскопии.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как сканирующая электронная микроскопия, заключается в том, что она позволяет определить внутреннюю структуру колонии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития микроорганизмов, такие как распределение типов клеток внутри колоний. Этот метод позволил получить представление о структуре колоний CAC, но вполне вероятно, что он может быть применен и к другим микроорганизмам.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как обработку и встраивание колоний может быть трудно изучить по письменному протоколу. Идея этого метода была вдохновлена некоторыми генетическими данными, которые мы опубликовали в 2002 году, которые показали, что споры не были равномерно распределены в колониях. Мы адаптировали метод секционирования колоний, который был разработан Энгельбергом в лаборатории плавников.

Итак, приступим. Начните с инкубации дрожжей Wild S visi на шнековых пластинах при температуре 30 градусов, пока не образуется около 300 колоний. С помощью узкого шпателя удаляйте колонии диаметром от одного до двух миллиметров, по одной от плиты.

Затем с помощью одномиллилитровой пипетки поместите несколько капель 2%-ного агара при температуре 42 градуса Цельсия на предметное стекло микроскопа и сразу же поместите колонию на агар лицевой стороной вверх, прежде чем AER затвердеет. Нанесите еще несколько капель агара на колонию и дайте агару застыть, чтобы вся колония, включая верхнюю часть колонии, была заключена в агар. Во всех последующих протокольных шагах с бритвенным лезвием.

Обрежьте AER вокруг колонии и разместите блок AER, содержащий колонию. В флаконе с завинчивающейся крышкой объемом 3,5 миллилитра bo силикат, содержащем 2% параформного альдегида и 2% фиксирующих колонии глутарового альдегида, необходимо обрабатывать по одной, чтобы предотвратить высыхание, но в тот же флакон можно поместить до 10 колоний. Оставьте колонии на семь дней при температуре четыре градуса по Цельсию.

Через неделю снимите фиксатор и промойте агроколонии дважды, используя примерно 1,5 миллилитра 0,15 молярного натрия. Выдержать при pH 7,2 и выдерживать на льду после каждой стирки в течение 15 минут без перемешивания. После этого промываем еще два раза.

Использование 1,5 миллилитров одного буфера X OS, состоящего из 100 миллимоляров монофосфата калия, 10 миллимоляров хлорида магния при pH 6,0, инкубация на льду в течение пяти минут после каждой стирки. Затем, используя тот же флакон, проведите обработку осмием и промывку, перечисленные здесь и в письменной части этого протокола. Затем снова, используя тот же флакон, выполните поэтапное обезвоживание, перечисленное здесь и в сопроводительном письменном протоколе, рано утром следующего дня.

Приготовьте реагент для шпор, как показано здесь и в сопроводительном письменном протоколе. Немедленно промойте агроблоки пять раз по 10 минут каждый с 1,5 миллилитрами 100% этанола комнатной температуры. После последней промывки этанолом удалите только достаточное количество этанола, чтобы агроблок оставался закрытым.

С помощью пастбищной пипетки поместите во флакон примерно 0,5 миллилитра шпорцевого реактива и вращайте на колесе с небольшой скоростью в течение 15 минут. При комнатной температуре после вращения дайте флакону постоять 30 минут. Далее удалите раствор полностью.

Затем добавьте 1,5 миллилитра реагента для шпор, чтобы покрыть агриблок. Снова вращаем флакон на колесе в течение 15 минут при комнатной температуре и даем постоять 30 минут. Повторите эту стирку.

Сделайте шаг еще три раза. По истечении последних 30 минут удалите шпоры реагента и добавьте свежий шпоры реактива, чтобы покрыть блоки. Дайте сельскохозяйственным блокам постоять при комнатной температуре в течение четырех часов.

Замените шпоры реагента и поверните на ночь. На следующее утро замените реагент «шпоры» и оставьте флаконы вращаться до следующего дня. На следующее утро поместите реактив «шпоры» в пронумерованные силиконовые формы, чтобы покрыть только дно форм.

Затем поместите сельскохозяйственные блоки в формы и выдерживайте при температуре 60 градусов Цельсия в течение четырех часов. Через четыре часа добавьте в формы еще больше шпор, реагента и инкубируйте при температуре 60 градусов Цельсия в течение ночи. Выньте блоки из формы для секционирования.

Здесь показан пример световой микрофотографии разреза через центр колонии колонии дрожжей Wild S Visia. Эти дрожжи представляют собой штамм дикого типа, выделенный из древесных экссудатов. Колонию инкубировали в течение шести дней на среде YNA перед разделением.

На этом изображении асаи, псевдогифи и яйцевидные дрожжи легко различимы, а также очевидна область колонии, вторгающейся в нижележащий агар. Открытые стрелки указывают на репрезентативные асаи, закрашенные стрелки указывают на репрезентативные яйцевидные вегетативные клетки, заполненные стрелки указывают на цепочки удлиненных клеток и si. Это изображение представляет собой пример электронной микрофотографии из тонкого среза лабораторного штамма дрожжей SH 1 0 2 0 и W 3 0 3.Фон.

Колонию инкубировали в течение шести дней на среде YNA перед разделением. На изображении показана область колонии, содержащая высокую частоту спорулированных клеток. Стрелка указывает на двухслойную структуру стенки споры.

В части А мы показываем сечение четырехдневной колонии с сеткой, состоящей из 15 прямоугольников, наложенных на изображение в части В. Частота клеток, связанных со спорами, в каждом прямоугольнике является трансплантатом с 15 столбиками, соответствующими 15 прямоугольникам, показанным в части А. Данные представляют собой среднее значение и стандартную ошибку четырех независимых четырехдневных колоний В части С, Показаны средние значения и стандартные погрешности для четырех независимых восьмидневных колоний. После освоения этой техники ее можно выполнять за две недели с одним полным днем и несколькими днями от одного до трех часов. При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать добавлять растворы сразу, чтобы блоки не высохли

Другие методы, такие как иммуноэлектронная микроскопия, могут быть использованы для определения распределения клеток, экспрессирующих определенные белки, после их развития. Этот метод позволил нам взглянуть не только на структурирование спорулатных клеток, но и на структурирование псевдогифальных клеток в колониях croce CCI. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как заделывать колонии дрожжей для раздела.

Не забывайте, что многие реактивы для микроскопии, используемые в этом протоколе, могут быть чрезвычайно опасными. Пожалуйста, не забывайте использовать вытяжной шкаф, надевайте защитную одежду и правильно утилизируйте реагенты. Ладно, вот и все.

Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах.