Встраивание парафин и тонкий секционирование колонии микробной биоплёнки для микроскопического анализа

Общая цель этой процедуры заключается в создании срезов биопленки, встроенных в парафин, которые могут быть использованы для оценки распределения экспрессии генов, о чем сообщается при производстве флуоресцентных белков в пределах интактных нативных морфологий. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении микробных сообществ, например, как экспрессия специфических генов в производстве экзополимерных веществ распределяется в контексте нативной биопленочной архитектуры. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет анализировать экспрессию генов в пределах сохраненной морфологии поперечных срезов биопленки, а также поддается последующим обработкам, таким как окрашивание отдельных особенностей и визуализация с высоким разрешением, такая как конфокальная или электронная микроскопия.

После приготовления раствора триптона агара согласно текстовому протоколу с помощью 50-миллилитровой конической трубки налейте 45 миллилитров раствора в квадратную посуду размером 100 на 100 миллиметров. Дайте агару застыть примерно от 20 до 30 минут. Поверх первого слоя насыпьте второй 15-миллиметровый слой, затем дайте ему застыть в течение ночи, а при необходимости используйте безворсовую салфетку для удаления конденсата с крышек.

Затем, чтобы обнаружить биопленки колонии, после выращивания изолированной одиночной колонии P.Aeruginosa из замороженного поголовья в соответствии с текстовым протоколом, пипеткой нанесите от 2,5 до 10 микролитров клеточной суспензии на средний двухслойный планшет. Колонии могут инкубироваться в темноте при температуре 25 градусов Цельсия при относительной влажности от 80 до 100% в течение четырех дней. Аккуратно вылейте 15 миллилитров раствора агара на питательную среду и колонию и дайте агару образовать гель при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем с помощью острого лезвия бритвы отрежьте квадратный трехслойный патрон с колонией, ламинированной между двумя верхними слоями. При подготовке нескольких образцов убедитесь, что каждый патрон обрезан до сопоставимого размера. Аккуратно удалите излишки агара из колонии, содержащей лопаточный патрон.

Затем смочите плоскую головку шпателя в PBS или воде и аккуратно вставьте ее между верхним и нижним слоями агара. Немедленно переложите ламинированную колонию в закладную кассету с маркировкой химически стойкой маркировочной ручкой. Поместите встраиваемую кассету в почтовую машину со стеклянным предметным стеколом, содержащую заранее подготовленный фиксатор.

Обработайте образцы. Используйте 1X PBS для стирки их дважды по одному часу каждый. Для достижения наилучших результатов автоматизируйте гомогенизацию реагентов с помощью низких настроек функции вращения автоматического тканевого процессора.

Чтобы заложить образцы, заполните восковую форму расплавленным парафином, нагретым до 55 градусов Цельсия, затем с помощью нагретого плоского шпателя быстро перенесите инфильтрированный патрон из загрузочной кассеты в восковую форму, следя за тем, чтобы патрон лежал параллельно основанию формы. Дайте воску застыть в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Образцы, отлитые из твердого воска, могут храниться при этой температуре неограниченное время.

Как только воск застынет, вырежьте образец из формы и с помощью лезвия бритвы удалите излишки воска вокруг образца. Оставьте немного воска, выступающего с одного конца образца, который можно использовать для его зажима в микрофолианте. Важно обрезать залитый воском образец так, чтобы его форма облегчала сбор гладких линейных лент.

Небольшие дефекты обрезки могут привести к появлению артефактов на ленте и нарушению целостности сечения. Далее нагрейте водяную баню до 42 градусов по Цельсию. Затем зажмите образец в микротоме так, чтобы поверхность колонии была ориентирована перпендикулярно краю лопасти

Обрезайте образец с интервалом 50 микрометров до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плоскость колонии, из которой будут собираться срезы с помощью микротома, установленного на скорость среза от 75 до 80 оборотов в минуту и угол зазора от шести до 10 градусов. Отрежьте ленту нужного количества участков толщиной 10 микрометров. Затем с помощью кисти с тонким наконечником отсоедините ленту от лезвия.

Теперь с помощью щипцов или капли воды на кончике пастеровской пипетки аккуратно перенесите ленту на водяную баню. Сразу же вставьте горку в водяную баню и расположите ее ниже ленты под углом 45 градусов. Прикоснитесь узким краем ленты к предметному стеклу чуть ниже матовой этикетки.

Лента должна держаться. Вытащите горку из водяной бани и отрегулируйте угол так, чтобы она была перпендикулярна поверхности воды, позволяя ленте ровно прилегать к горке по всей ее длине. Избегайте попадания лишней воды под ленту.

Аккуратно насадите горку на впитывающую безворсовую ткань, отводящую лишнюю воду из секции. Затем разложите горку на бумажное полотенце и дайте ей высохнуть в темноте при комнатной температуре в течение ночи. Нагрейте выровненную конфорку до 45 градусов Цельсия и поставьте горку на тарелку на 30-60 минут.

Воск станет полурасплавленным и расплющится относительно предметного стекла. Аккуратно снимите предметное стекло с горячей плиты и положите его на гладкую ровную поверхность комнатной температуры примерно на одну минуту, пока воск не застынет. Следите за тем, чтобы расплавленный воск не тянул ни в одну из сторон предметного стекла.

Поместив образцы в стеклянную почтовую машину, очистите слайды от воска в четыре промывки очищающего средства в течение пяти минут каждая. Используйте аспиратор Бюхнера для удаления раствора между стирками. Используйте 100% этанол для мытья предметных стекол три раза по одной минуте каждый.

Затем, после регидратации слайдов в соответствии с текстовым протоколом, немедленно установите секции в монтажную среду с трехбуферной буферизацией и наклейте покровное стекло. Накладной агар вокруг секции не вступает в реакцию с фиксатором, поэтому не прилипает к мангольду. Этот агар может сместиться во время регидратации и повредить секцию, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы не перемешать раствор во время регидратации.

Дайте монтажному материалу полимеризоваться при комнатной температуре в течение ночи. После полимеризации используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы приклеить покровное стекло к предметному стеклу. Наконец, храните запечатанные предметные стекла неограниченное время в темноте при температуре четыре градуса Цельсия.

В то время как ДВС-визуализация с использованием 40-кратного масляного иммерсионного объектива может быть достаточной для демонстрации некоторых морфологических особенностей тонких срезов биопленки, флуоресцентная микроскопия штаммов, разработанных для конститутивной экспрессии флуоресцентных белков, обеспечивает улучшенную визуализацию клеточного распределения в образцах. Как показано на этих панелях, изображения отдельных срезов могут быть сшиты вместе, чтобы получить поперечное сечение всей колонии и обеспечить контекст для локализации структурных особенностей в рамках общей морфологии на макроскопическом уровне. Использование штамма, сконструированного для экспрессии флуоресцентного белка под контролем определенного промотора, позволяет визуализировать распределение экспрессии генов.

Кроме того, колонии могут быть выращены на среде, содержащей красители, или красители могут быть добавлены после среза к полисахаридам, специфичным для окрашивания. Наконец, образцы также могут быть подготовлены и визуализированы с более высоким разрешением с помощью просвечивающей электронной микроскопии, как показано здесь. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о вагуляции образцов и о возможности введения флуоресцентных и структурных артефактов в результате фиксации, среза или регидратации, которые могут повлиять на интерпретацию данных.

Эта процедура позволяет проводить количественный анализ изображений, такой как корреляция профилей экспрессии флуоресцентных репортеров с морфологическими особенностями и осью Z биопленки. Этот протокол может быть применен к различным видам биопленкообразующих микробов, имеющих медицинское и промышленное значение, таким как Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae и Bacillus subtilis. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать и готовить биопленки колоний к разделу с помощью заделки парафином.