Улучшенная Визуализация и количественный анализ на наркотики эффекты с помощью Micropatterned Клетки

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы показать, как нормализация архитектуры и положения клеток, достигнутая на конкретных адгезивных микроузорах, позволяет легко автоматизировать получение изображений и прямую обработку изображений с чувствительной и надежной количественной оценкой эффектов лекарств, что недостижимо на обычных опорах со стеклянной крышкой. Это достигается путем засеивания гелийских клеток на двух чипах SI, которые несут L-образные микроузоры SI с тремя мечеными. Клетки принимают треугольную форму, образуя основное стрессовое волокно, охватывающее два конца L. Затем клетки модели инкубируют со статином лебо или оставляют без обработки, а затем фиксируют и окрашивают для визуализации актона, цитоскелета и ядер.

Затем изображения клеток микропаттернов получают и обрабатывают с использованием макроса ссылки на ячейку для генерации стека изображений для анализа и макроса гипотенузы для количественной оценки фенотипов. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые демонстрируют значительное влияние низких доз статина BLEs на микроклетки HELOC, что не обнаруживается в стандартных условиях культивирования клеток. Здравствуйте, добро пожаловать.

Сегодня мы здесь, чтобы познакомить вас с нашим экспериментальным протоколом, объясняющим, как использовать адгезивные микропаттерны для клеточного анализа, а также показать вам экспериментальные данные, иллюстрирующие простое количественное определение очень низких доз лекарств на этих адгезивных микропаттернах. Поэтому, когда вы впервые увидите эти микропаттерны, вы сразу поймете, как они могут решить проблемы изменчивости при захвате изображений во время клеточного анализа. Потому что, имея действительно массив клеток, очень похожий на микрочип, вы можете легко перемещать предметный столик микроскопа от клетки к клетке, чтобы иметь возможность получать изображения поэтапно.

Но это, конечно, не единственное преимущество микроузоров, которое он предлагает. Это дает гораздо больше улучшений, потому что на самом деле, на определенных типичных микропаттернах, таких как перекрестный или Y, мы фактически нормализуем внутреннюю клеточную архитектуру, что означает, что органеллы, митотическое веретено, цитоскелет и различные белковые сети находятся в одних и тех же местах от клетки к клетке или в одной и той же ориентации от клетки к клетке. Что значительно облегчает прогнозирование и количественную оценку влияния лекарств на эти конкретные паттерны. Это может показаться совершенно нелогичным по сравнению с тем, что обычно делается в классической чашке Петри или микропланшете.

Ну, потому что вы, конечно, часто видите, как клетки перемещаются и принимают различную морфологию. В то время как на адгезивных микропаттернах все клетки начнут выглядеть одинаково, потому что они реагируют на этот адгезивный микропаттерн и организуют свою архитектуру одинаковым образом. На самом деле это может показаться немного искусственным, но если присмотреться к этому внимательно, не является ли чашка Петри еще более искусственной?

Потому что в тканях клетки ограничены соседними клетками, а также внеклеточным матриксом. Таким образом, они получают много пространственной информации, которая ориентирует архитектуру клетки. И это на месте для рекламы микроузоров - это то, что мы делаем.

Мы восстанавливаем эту пространственную информацию в клетках, и все клетки реагируют на это и организуются таким же образом. И теперь, поскольку все ячейки похожи друг на друга, мы можем ввести концепцию эталонной ячейки, что означает, что мы можем усреднить все изображения и получить одно изображение, которое действительно репрезентативно для того, как выглядит ячейка в заданных условиях. Затем вы можете добавить лекарство и снова посмотреть на эту референсную клетку и увидеть, как она изменила морфологию или организацию клетки в ответ на это лекарство.

Поместите две микросхемы по отдельности в два независимых отверстия шестилуночной пластины, убедившись, что логотип на месте два хорошо читается. Чипы situ two, использованные для этого эксперимента, имеют микроузоры, окрашенные FibroGen SI 3, и их следует хранить в темноте перед использованием. Соберите хела-клетки, которые примерно на 80% сливаются с трипсином, и проверьте, правильно ли они индивидуализированы под микроскопом, центрифугой при 300 G в течение четырех минут, и восстановите суспензию клеток, аккуратно подсчитайте и разбавьте клетки до концентрации 15 000 клеток на миллилитр.

В неполных культуральных средах D-M-E-M-F 12 дозируют 60 000 клеток на лунку. Пластину следует перемещать как можно меньше, чтобы избежать введения вращательных движений в среду, которые будут иметь тенденцию к концентрации клеток в центре. Дайте клеткам отстояться в течение 10 минут под колпаком, затем переместите их в инкубатор для клеток.

В течение 10-20 минут в клеточном инкубаторе клетки начнут прилипать уже через 10 минут, регулярно проверяйте под микроскопом, когда клетки прикрепились. Смените клеточную среду и удалите излишки клеток, повторив следующую процедуру четыре раза. Удерживая пластину ровной, аккуратно отсасывайте среду со стороны лунки.

Будьте осторожны, чтобы сохранить достаточное количество носителя, чтобы избежать высыхания чипа. Добавьте четыре миллилитра PBS и аспирируйте, начиная с центра чипа. Затем, двигаясь к боковой части лунки, чтобы аспирировать большую часть PBS, как и раньше, проверьте под микроскопом наличие плавающих клеток.

Если осталось большое количество плавающих ячеек, повторите процедуру промывки. Если клеток очень мало, отсасывайте часть PBS и замените ее двумя миллилитрами аспирата свежей среды и дважды добавьте четыре миллилитра свежей среды. Инкубируйте клетки в течение трех часов в клеточном инкубаторе, чтобы дать им возможность полностью распространиться.

При использовании этого метода от 10 до 30% микропаттернов будут заняты одной ячейкой, в то время как другие паттерны будут либо пустыми, либо занятыми несколькими ячейками. Для обработки клеток с помощью статинов статины разбавляют 17 миллимолярный исходный раствор препарата до конечной концентрации пяти микромоляров с 0,1% ДМСО в четырех миллилитрах среды. Для контрольной среды с 0,1% ДМСО отсасывайте только клеточную среду и быстро заменяйте ее статинами BLEs или контрольными растворами, чтобы избежать высыхания чипа.

Инкубируйте клетки в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Во время такой инкубации подготовьте буфер для цитоскелета. Добавьте один грамм сахарозы к двум миллилитрам кб.

Это помогает сохранить внутренние клеточные структуры. Смешайте один миллилитр сахарозы CB с четырьмя миллилитрами 5% PFA. Добавьте два миллилитра PFA в раствор сахарозы CB.

В двух лунках свежая шестилуночная тарелка. Для фиксации клеток с помощью щипцов забирают CY-два чипа и помещают его в шестилуночный планшет, содержащий два миллилитра PFA в растворе сахарозы CB. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при комнатной температуре, удалите PFA и промойте клетки один раз PBS, затем промойте клетки двумя миллилитрами 100 миллимолярного хлорида аммония в течение 10 минут.

Чтобы погасить остаточную сшивающую активность PFA, проницаемость клеток путем добавления двух миллилитров PBS, содержащих 0,1% триттона X 100, в течение трех минут, дважды промытых красителем PBS актиновых филаментов с двумя миллилитрами конъюгированной ZI файна от одного до 2000 в PBS с 1,5% BSA, инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. Затем промойте клетки один раз двумя миллилитрами PBS. Далее поддержите ядра.

Добавьте два миллилитра по одному миллиграмму на миллилитр, выращенный в PBS, и выдерживайте в течение трех минут при комнатной температуре. Дважды умыться двумя миллилитрами PBS. Установите две боковые микросхемы на стандартное предметное стекло, используя от 25 до 30 микролитров монтажных растворов, таких как al.

Для получения изображений в трех длинах волн мы используем программное обеспечение для визуализации Metamorph и микроскоп NIK icon eclipse T. Оснащен камерой CCD Hema Matsu и осветителем из ртутного волокна intens lite. Сначала выберите 20-кратное увеличение.

Далее в строке меню откройте многомерное получение. Чтобы настроить различные параметры эксперимента. Сначала укажите, где сохранить ваши данные.

Установите количество длин волн равным трем, выберите три длины волны СИ и расположите защитный слайд так, чтобы 12 микрошаблонов были центрированы в поле камеры. Количество визуализируемых микроузоров в каждом поле будет варьироваться в зависимости от настройки камеры и объектива. Установите время экспозиции для каждой длины волны и автофокуса.

Для PS 3 создайте журнал, выполняющий многомерный сбор данных, и сохраните его как MDA jnl. Откройте функцию этапа сканирования, чтобы получить 24 изображения, каждое из которых содержит 12 микроузоров. Введите шесть столбцов и четыре строки с размером шага минус 400 микрон x и размером шага 300 микрон y в установленный журнал для выполнения, загрузите журнал MDA JNL press scan для запуска автоматического получения 24 изображений на трех длинах волн.

В этом видео L-микропаттерны используются для запуска формирования одного основного стрессового волокна актина, которое поддерживает неприкрепленную часть клетки, и упрощают визуализацию и измерение влияния статина BLEs на клетки по сравнению с клетками, сидящими на простом фибронектине. Для автоматизированной обработки и анализа изображений мы выделяем два специально созданных макроса, написанных для программы с открытым исходным кодом image J из стека необработанных изображений, первый макрос извлекает отдельные ячейки и создает эталонную ячейку. Второй макрос измеряет разрушение клеточной мембраны.

Первым шагом является сегментация отдельных ячеек из необработанных изображений. Флуоресцентно помеченные изображения микроузоров используются для выделения областей, сосредоточенных на микроузорах, которые обрезаются на изображениях для каждой длины волны и собираются в стеки для каждой длины волны. Чтобы выбрать микропаттерны с отдельными клетками, макрос определяет количество ядер на изображение и устраняет во всех стеках те, которые содержат либо более одного ядра, либо не содержат ядер.

Наконец, плагин image J multi-stack reg используется для выравнивания всех собранных изображений и всех каналов на основе положения микропаттерна. На этом шаге генерируются стеки отдельных изображений, которые теперь можно использовать для анализа отдельных ячеек или для создания опорной ячейки. На рисунке J эталонная ячейка конструируется путем проекции отфильтрованных и выровненных изображений из стопки.

Можно применять несколько методов проекции, но обычно для исключения выбросов из стека изображений выбирается медианная проекция. Эталонная ячейка является уникальным и полезным инструментом для представления и анализа изображений, полученных только с помощью микрошаблонных ячеек. Чтобы облегчить его изучение, применяется таблица подстановки или LUT для преобразования моноцветного изображения в кодированную частотную карту.

Чтобы охарактеризовать эффект статинов BLEs, жесткость и коллапс клетки были проанализированы с помощью второго макроса изображения J. Вкратце, пороговые изображения паттерна L micro используются для определения теоретической гипотенузы формы клеточного треугольника. Далее выполняется пороговое определение изображений актонового окрашивания для определения формы клетки.

Затем измеряется разница в площади между теоретической гипотенузой и фактической вогнутой клеточной мембраной; клетки, имеющие площадь под теоретической гипотенузой, считаются коллапсированными. Воздействие пяти микромолярных статинов BLEs характеризовали путем сравнения количества коллапсированных клеток в обработанных и контрольных условиях. На типичных изображениях клеток L-микропаттерна, обработанных статинами или оставленных необработанными, показаны клетки, которые были зафиксированы и окрашены.

Актин и ядра показаны красным, зеленым и синим цветом соответственно. Обратите внимание на влияние статинов BLEs на форму клеток по сравнению с контрольными условиями. Здесь показаны репрезентативные клетки после инкубации статинами BLEs или контрольной группой на обычном фибронектине.

Клетки были зафиксированы и окрашены актином и ядрами в зеленый и синий цвета соответственно. Обратите внимание на сходство между леченными и контролируемыми состояниями. Показаны типичные изображения референсных клеток, полученных из клеток, обработанных статинами BLEs или оставленных необработанными.

Обратите внимание на потенциал этого подхода для облегчения наблюдения за изучаемым фенотипом. Вот пример анализа влияния статинов BLEs на клетки с использованием макрогипотенузы. В то время как 25% контрольных клеток были разрушены, этот показатель увеличился в три раза на 75% в пяти микромолярных клетках, обработанных статинами, что отражает ослабленную сократительную сеть актинина.

Посмотрев это, вы должны хорошо понять, как адгезивные микроузоры решают несколько узких мест в анализе высокого содержания. Во-первых, использование адгезивных микроузоров значительно упростило анализ обработки изображений. Во-вторых, микропаттерны позволяют обнаруживать очень тонкие эффекты лекарств при очень низких дозах, потому что вы снижаете межклеточную изменчивость, нормализуя их морфологию и поведение.

И, наконец, по сравнению с тысячами клеток, которые обычно необходимы для получения хорошего результата в клеточном анализе, вам нужно всего несколько десятков клеток, чтобы получить надежный и значимый результат с использованием нашей контрольной ячейки.