Конкурентные Homing Анализы по изучению тропических Гут-Т-клеток миграции

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы сравнить специфические для тканей миграционные способности двух или более подмножеств клеток у одной и той же мыши-реципиента, что позволяет анализировать множество тканей и клеток в одном эксперименте. Здесь мы показываем метод сравнения миграционных способностей in vitro сгенерированных кишечных тропиков и контрольных Т-клеток у мышей-реципиентов дикого типа. Метод может быть использован, например, для определения способности тропных Т-клеток кишечника мигрировать в кишечные брыжеечные лимфатические узлы, периферические лимфатические узлы и селезенку.

По сравнению с контрольными Т-клетками, первые кишечные тропные и контрольные эффекторные Т-клетки должны быть сгенерированы in vitro. Затем экспериментальные и контролируемые Т-клетки должны быть помечены дифференциальными красителями и смешаны в соотношении один к одному. Затем клеточная смесь, за исключением небольшого Eloqua, используемого для подтверждения входного соотношения, вводится в мышь-реципиент.

Наконец, мышь умерщвляют через 18 часов после адоптивного переноса, а представляющие интерес органы анализируют на наличие кишечных тропных и контрольных Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как принятый перенос популяции одиночных клеток, заключается в том, что комбинация различных подтипов вводится одним и тем же мышам-реципиентам, что значительно снижает вариабельность, связанную с внутривенным введением или использованием разных мышей-реципиентов. Применение этой техники распространяется на нашу терапию заболеваний, связанных с массивной инфильтрацией лейкоцитов, таких как воспалительные заболевания кишечника.

Например, это позволяет определить, сколько молекул требуется как при нормальной, так и во время миграции араньских лимфоцитов в кишечник. Кроме того, эта процедура позволяет нам оценить эффективность препаратов, предназначенных для блокирования кода трафика лейкоцитов в каждой лунке 24-луночного планшета с 500 микролитрами PBS, содержащими 10 мг на миллилитр, антитела против CD 3 и против CD 28. Инкубируйте планшет в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе, пока лунки покрываются.

Принесите в жертву мышь дикого вида и рассеките селезенку, поместив ее в 50-миллилитровую трубку со средой. Изолируйте циты PLE, поместив селезенку между двумя предметными стеклами микроскопа и размяв ее над чашкой Петри. Резонатор суспензирует клетки в PBS, пипетирует клеточную суспензию в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугирует в течение пяти минут.

При 400 G при комнатной температуре удалите снат и лизируйте эритроциты с помощью Резуса, суспендируя клеточную гранулу в четырех миллилитрах действующего буфера для лизиса на две-три минуты. Остановите лизис пятью миллилитрами PBS, снова центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут при 400 G при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Взвесьте полученную гранулу в одном умножить на 10 из шести ячеек на миллилитр в цельный лед.

Коув модифицируют среду delcos или IMDM поровну, делят полученную клеточную суспензию между двумя отдельными пробирками, дополняя одну из пробирок всей транс-ретиноевой кислотой или RA до конечной концентрации от 100 до 200 наномолярных кубических концентраций. Защищайте трубку от прямого света, чтобы избежать разложения транс-ретиноевой кислоты. Выньте из инкубатора пластину на 24 лунки и дважды промойте каждую лунку двумя миллилитрами PBS.

Добавьте от 1,5 до двух миллилитров суспензии клеток с добавлением РА в половину 24-луночного планшета. Затем добавьте такое же количество контрольных ячеек в каждую лунку второй половины 24-луночной пластины и верните планшет в инкубатор. Через два-три дня перенесите клеточные суспензии в новую 24-луночную пластину без покрытия.

Чтобы избежать чрезмерной стимуляции Т-клеток, инкубируйте клетки еще два-три дня. Если среда становится желтой в зависимости от плотности клеток и/или пролиферации, добавьте 500 микролитров свежего IMDM в каждую лунку, чтобы достичь конечного объема в один миллилитр на лунку. Чтобы собрать клетки, соберите надосадочную жидкость на четвертый или пятый день, считая день, когда клетки были покрыты, как нулевой день.

Типичный конечный выход составляет один-два умножения на 10 из шести эффекторных Т-клеток на лунку. Таким образом, следует покрыть как минимум от 9 до 12 лунок каждой из кишечных тропиков и контролируемых Т-клеток, чтобы получить от 10 до 20 умножить на 10 до шести Т-клеток в группе. Чтобы проверить уровни экспрессии альфа-4, бета-7 и CCR 9 на ra.

Активированные и контролируемые Т-клетки собирают от 0,2 до 0,5 умножить на 10-ю шестую часть свежесобранных экспериментальных и контрольных клеток в четыре миллилитровые факсимильные пробирки и центрифугу. Трубки в течение пяти минут при 300 G при четырех градусах Цельсия. Отбросить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 100 микролитрах окрашивающего буфера, инкубировать с анти-CD четырьмя FSE, ANTIFA четыре, бета-семью pe, анти-CCR девятью PC, и анти-CD восемью на P в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.

После инкубации промойте клетки PBS в течение пяти минут при 300 GS четырех градусах Цельсия, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в окрашивании. Снова внесите буфер и проанализируйте с помощью проточной цитометрии в начале этого шага. Разогрейте бутылку IMDM и бутылку PBS до 37 градусов Цельсия для последующего использования в протоколе окрашивания.

После подтверждения фенотипов хоуминга Т-клеток двух клеточных культур с помощью проточной цитометрии, как описано на предыдущем этапе центрифуги, свежесобранные альфа-4, бета-7, высокий CCR девять, высокий кишечный тропик и альфа-4, бета-7, низкий или отрицательный CCR девять низких или отрицательных контролируемых Т-клеточных популяций при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем промойте клетки еще два раза PBS, чтобы удалить сыворотку, а затем отрегулируйте концентрацию Т-клеток для каждой группы до 10-15 умно-10 до шести клеток на миллилитр. При добавлении PBS CFSE или C-M-T-M-R умирает либо к кишечным тропным Т-клеткам, либо к контрольным Т-клеткам.

Здесь CFSE добавляется к популяции контрольных клеток, а C-M-T-M-R добавляется в кишечник. Тропные Т-клетки до конечной концентрации 5 миллимоляров и 10 миллимоляров соответственно осторожно перебивают клетки вихрем в течение пяти секунд и инкубируют пробирки в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане после инкубационного периода. Остановите окрашивание с добавлением пяти миллилитров FPS и выдержите от одной до пяти минут при комнатной температуре.

Разбавьте в 10 раз теплой PBS и центрифугируйте в течение пяти минут при 300 G при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте еще два раза PBS и повторно суспендируйте клетки в полном IMDM. В идеале, от 10 до 20 раз по 10-й из шести клеток каждой популяции Т-клеток должны быть смешаны в четырех миллилитровых факсимильных трубках в соотношении один к одному.

Чтобы рассчитать точное соотношение ввода, сохраните от пяти до 10 микролитров введенной суспензии клеток трубки, которая называется входной, и поддерживайте его при температуре четыре градуса Цельсия центрифугируйте клеточную смесь, которая будет вводиться, при 300 Gs в течение пяти минут. При комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки, подлежащие введению, в количестве от 250 до 300 микролитров теплой нагрузки PBS, инсулиновый шприц с одним CC иглой 28 калибра с клетками для инъекции.

Введите 250 микролитров клеточной смеси через хвостовую вену. Наконец, проанализируйте входные клетки с помощью проточной цитометрии, чтобы получить процентное содержание CFSE и C-M-T-M-R положительных клеток, которые были введены ранее. Это и будет используемый коэффициент ввода.

В итоговом расчете индекса самонаведения. Мы суспензируем образцы клеток из тканей для анализа хоуминга Т-клеток с плотностью не выше трех умножить на 10 из шести клеток на миллилитр. Если в качестве реципиентов для этого видео используются конгенные мыши, то CD 45.1 положительные были окрашены соответствующим конгенным маркером в сочетании с некоторым маркером линии, во время проточного цитометрического анализа забили клетки на выбранный конгенный маркер, а затем на специфический маркер линии CD 8, и проанализировали соотношения между C-M-T-M-R и CFSE положительными клетками.

Затем данные выражаются в виде индекса самонаведения или hi, который рассчитывается как отношение между двумя различными красителями в каждой ткани, деленное на соответствующее входное отношение. Входное отношение представляет собой отношение положительных CFSE клеток к CMTM TMR-положительным клеткам в шприце до инъекции, рассчитанное из 5-10 микролитров аликвоты клеточной суспензии, которая была отложена и проанализирована с помощью проточной цитометрии для этой цели. Если входное отношение очень близко к единице, то тканевые соотношения будут эквивалентны hi.

Если HI и кровь значительно отличаются от единицы, HI в анализируемых тканях может быть нормализована по HI в крови путем расчета соотношения HI в тканях, разделенных на HI в клеточных суспензиях, полученных из селезенки, периферических лимфатических узлов или брыжеечных лимфатических узлов PLN или MLN и Lamin propria или LP в тонкой кишке через 18 часов после инъекции. Были проанализированы экспрессия C-M-T-M-R и CFSE на закрытых CD восьми положительных CD 45.1 положительных клетках RA активировали альфа четыре, бета семь и CCR девять экспрессирующих C-M-T-M-R положительные Т-клетки, расположенные в селезенке в равных количествах для контроля CFSE-положительных клеток, но продемонстрировали заметное увеличение хоуминга в кишечник и тренировку расчета HI для каждой ткани лимфатических тканей. Далее подтверждено, что кишечные тропные и контрольные Т-клетки в равной степени размещаются в селезенке, но, напротив, кишечные тропные Т-клетки мигрировали примерно в 10 раз эффективнее в ЛП по сравнению с контрольными Т-клетками после освоения процедуры.

Использование мышей с конгеном вместо выравнивания красителя может быть сделано для оценки миграционной способности дополнительных типов клеток, таких как дендритные клетки или микрофаги. Поскольку эти типы клеток имеют тенденцию терять краситель после введения мышам-реципиентам, использование конгенных животных позволяет лучше отслеживать клетки в течение гораздо более длительных периодов времени после принятого переноса.