Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro

Миграция Т-лимфоцитов происходит при хоуминге к лимфоидным органам, выходе из сосудистой сети и попадании в периферические ткани. Этот процесс включает в себя адгезивное взаимодействие поверхности Т-клеток с другими клетками. Для изучения этого явления in vitro Т-лимфоциты человека выделяют, культивируют и помещают на планшеты для культуры тканей, покрытые адгезивным белком.

ICAM один и хемокин SDF один. Затем можно получить и проанализировать изображения миграции Т-лимфоцитов. Здравствуйте, я Крейг ЛеФорт и работаю в лаборатории Минсу Кима в Центре биологии и иммунологии вакцин Рочестерского университета.

Сегодня мы покажем вам процедуру выделения и культивирования лимфоцитов подростка человека, анализ их миграции in vitro. Мы используем этот анализ в нашей лаборатории для изучения роли интегринов и миграции Т-клеток. Основным интегрином в Т-клетках является антиген один, ассоциированный с функцией лимфоцитов.

Специфическими лигандами для LFA one являются icas, такие как ICAM. Кроме того, родственный сигнал необходим для миграции Т-клеток, чтобы обеспечить как сигнал направленности, так и активировать интегрины. В нашем анализе мы используем человеческий ICAM one и CX CL 12 или SDF one в качестве субстратов для миграции Т-клеток.

Итак, приступим. После получения человеческой крови от здорового донора дайте крови остыть до комнатной температуры. На это уходит около 30 минут.

Как только кровь остынет, аккуратно пипеткой наберите три миллилитра градиента плотности комнатной температуры в полиморфную полистирольную пробирку с круглым дном объемом восемь миллилитров. Затем аккуратно добавьте сверху три миллилитра цельной крови. Важно избегать любого перемешивания.

Поместите пробирки в центрифугу и вращайте ее до 500 г в течение 45 минут. При комнатной температуре после центрифугирования мононуклеарные клетки периферической крови или P BMC отделяются от других компонентов крови. Слой PBMC отображается как первая облачная полоса сверху.

В стерильных условиях осторожно удалите и выбросьте прозрачную желтую верхнюю фазу. Затем с помощью микропипетки P 1000 перенесите слой PBMC на новую коническую трубку. Дважды промойте PBMC центрифугирующими ячейками PBS при 500 G в течение пяти минут.

Каждый раз надосадочная жидкость будет несколько мутнеть после каждого умывания. Повторно суспендируйте клетки в 20 миллилитрах среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина стрептомицина и один микрограмм на миллилитр. Инкубация фитогемагглютинина или PHA в присутствии PHA индуцирует активацию и расширение Т-лимфоцитов.

С помощью пипетки перенесите pbmc в колбу для культуры T 75. Далее инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение от одного до 24 часов. Этот этап позволяет отделить моноциты, которые будут прилипать к поверхности колбы, от лимфоцитов, оставшихся во взвешенном состоянии.

После инкубации тщательно удалите всю среду, которая содержит в основном лимфоциты, и перенесите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут. Риз был клеточной гранулой в RPMI 1640 и переносом клеток в новый T 75 flaz, содержащий 25 миллилитров RPMI 1640 с FBS, пенициллином, стрептомицином и PHA, инкубированным при 37 градусах Цельсия.

После 24 часов роста может потребоваться добавить от 15 до 20 миллилитров свежей среды и переложить в колбу большего размера T 1 75. Продолжайте инкубацию в течение трех дней или двух дней. Если первоначальная инкубация PBMC была ночной через три дня, используйте пипетку для удаления среды, которая будет содержать взвешенные лимфоциты, и перенесите ее в 50-миллилитровую коническую пробирку центрифуги при 500 G на пять минут.

Риз был клеточной гранулой и перенес элементы в новый T 75, содержащий 25 миллилитров RPMI 1640. С помощью FBS пенициллин, стрептомицин и человеческий IL 2 или IL 15 помещают клетки в инкубатор. Если начать использовать колбу с Т 75, культуру необходимо будет расширить и перенести в колбу с Т 1 75.

Через один-два дня растут лимфоциты в общей сложности от четырех до семи дней. За сутки до пробирного анализа покройте стеклянную посуду со стеклянным дном 0,17 миллиметра с 20 микрограммами на миллилитр белка А или G в PBS, инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия на следующий день. Тщательно вымойте тарелку с помощью PBS, затем добавьте в тарелку ICAM one FC и human SD F1 в растворе PBS.

Инкубируйте в течение четырех часов при комнатной температуре, чтобы обездвижить молекулы. Определяют плотность культивируемых клеток с помощью гемоцитометра. Затем дважды промыть лимфоциты с помощью PBS и повторно суспендировать их в одном миллилитре L 15 среды, содержащей D-глюкозу, после инкубации вымыть покрытую чашку с помощью ICAM one FC и SDF one в большом объеме с помощью PBS, перенести Т-лимфоциты в одном миллилитре среды в чашку, примерно от двух до пяти раз по 10 до пятой клетки следует использовать на одну чашку для достижения плотности клеток, подходящей для анализа миграции.

Чтобы получить изображения миграции клеток, поместите чашку на предметный столик микроскопа в среду с контролируемой температурой, например, в камеру, нагретую до 37 градусов Цельсия. Откройте программное обеспечение элементов NIS в меню настроек изображения. Выберите биннинг «два на два» в качестве режима как для создания изображений в реальном времени, так и для захвата изображений.

Зайдите в меню приложений и выберите, определите, запустите, поэкспериментируйте. Выберите промежуток времени между изображениями и общее время. Для последовательности захвата изображения нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать получение изображения после захвата.

Параметры миграции, такие как скорость, длина пути и смещение, могут быть количественно измерены с помощью программного пакета, такого как Image J, Auto Quant или veloc. Чтобы создать график паутины, соберите координаты XY для каждой ячейки и временной точки и спроецируйте их на график с общей начальной точкой для каждой ячейки в начале координат. Показанные здесь Т-лимфоциты были культивированы, покрыты на ICAM и SDF one и визуализированы каждые 10 секунд в течение 30 минут.

В этом фильме показана случайная миграция Т-лимфоцитов со скоростью примерно 15 микрон в минуту с использованием координат XYT для каждой клетки. 15 клеток были выбраны случайным образом и построены на графике с общей начальной точкой в начале координат. Сравнение графиков паутины дает быстрое визуальное изображение различий в миграции между различными экспериментальными условиями.

Графики миграции Т-лимфоцитов в контрольных условиях показаны слева, а графики миграции Т-лимфоцитов в присутствии антитела, блокирующего один лиганд анти-LFA, показаны справа. Эти данные показывают, что Т-лимфоциты используют интегрин LFA one для миграции на субстрат ICAM one. Мы только что показали вам, как провести миграционный анализ с использованием культивируемых Т-лимфоцитов человека во время процедуры.

Важно помнить о том, что необходимо добавить соответствующее количество клеток в чашку ICAM с одним покрытием, чтобы упростить отслеживание клеток и анализ миграции. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.