Связанные хромосомы Ловушка для выявления дальних взаимодействий ДНК

Общая цель следующего эксперимента заключается в обнаружении и идентификации ассоциированных партнеров по ДНК на большом расстоянии. Это достигается путем фиксации, лизиса клеток и расщепления ДНК первым ферментом рестрикции с последующим лигированием для создания химерной ДНК, состоящей из сегментов двух ассоциированных генов. Затем линкеры добавляются к химерной ДНК после второго рестрикционного расщепления Чтобы облегчить ее амплификацию, затем проводят ПЦР-амплификацию с использованием специфичных праймеров ДНК линкера и приманки с целью получения достаточного количества ассоциированных фрагментов ДНК Получают результаты, которые показывают дальнобойные ассоциированные партнеры ДНК с ДНК-приманкой на основе анализа последовательности амплифицированных фрагментов ДНК.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как захват хромосомных подтверждений или три С, заключается в том, что A-C-T-S-A может быть использован для эффективной идентификации неизвестного партнера по ДНК на большом расстоянии. В то время как три С возникали для верификации только ранее подозреваемых взаимодействий. Чтобы начать культивирование по этому протоколу, человеческие клетки в инкубаторе снабжаются 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока они не станут слитыми на 80-90%.

Для этой демонстрации используются клетки кислого лейкоза человека. Соберите клетки, налив их в 50-миллилитровую пробирку NOC и центрифугируйте при 1200 оборотах в минуту в течение 15 минут. После центрифугирования удалите среду с помощью аспирации.

Добавьте пять миллилитров питательной среды для ресуспендирования клеточных гранул. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра берут примерно один раз по 10 до седьмой клетки до объема 40 миллилитров с RPMI 1640, среду, содержащую 10% FBS. Затем добавьте 1,7 миллилитра 37%-ного формальдегида, чтобы зафиксировать разведенный хроматин.

Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 10 минут с легким встряхиванием. После инкубации погасите реакцию 2,4 миллилитрами двух моляров глицина. Затем центрифугируйте образец в течение 15 минут при 1200 об/мин и четырех градусах Цельсия.

После удаления супернатина промойте гранулу один раз 40 миллилитрами ледяного PBS, затем центрифугируйте образец для извлечения промытой клеточной гранулы, ресуспендируйте полученную гранулу в 40 миллилитрах ледяного буфера для лизиса со свежедобавленными ингибиторами протеазы и 0,1 миллимоляра PMSF, инкубируйте образец в холодном помещении с вращением в течение 90 минут. Наконец, центрифугируйте образец при 2500 об/мин в течение 15 минут, удалите супернатин и получите изолированные ядра. Повторно суспендируйте ядра в 0,5 миллилитрах одного буфера XNEB и добавьте 15 микролитров 10% SDS.

Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа с встряхиванием. Затем добавьте 45 микролитров 20% Triton X 100 для секвестрации SDS и снова инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа с встряхиванием и аликвотой один раз по 10 к шестому. Ядра или около 15 микрограмм используются для рестрикции ферментного расщепления до 55 микролитров раствора ядер.

Добавьте 433 микролитра одного буфера XNEB три и 12 микролитров BGL два. Чтобы общий объем реакции разложения составил 500 литров, инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день инактивируйте фермент рестрикции, добавив 95 микролитров 10% SDS, и денатурируйте фермент путем нагревания при 65 градусах Цельсия в течение 20 минут.

На водяной бане добавьте семь миллилитров одного буфера для лигирования и 360 микролитров 20% Triton X 100. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Понизьте температуру до 16 градусов по Цельсию и добавьте 50 микролитров по 400 единиц на микролитр.

T четыре ДНК лигазы. Дайте реакции лигирования инкубироваться при температуре 16 градусов Цельсия в течение четырех часов, а затем при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения лигирования добавьте 300 мкг протеиназы К и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи.

Затем добавьте пять микрограммов РНК и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Очистите ДНК с помощью фенола, хлороформа и осаждайте ДНК в изопропаноле, растворите осажденную ДНК в 150 микролитрах стерильной дистиллированной воды. Чтобы добавить линкеры к химерной ДНК, сначала расщепите ДНК путем инкубации двух микрограммов очищенной ДНК с пятью единицами MSP, одной при 37 градусах Цельсия в течение четырех-шести часов после переваривания, инактивируйте одну MSP при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем осадите ДНК в этаноле из расчета один микролитр пять миллиграммов на миллилитр. Гликоген растворяет полученное небо ДНК в 50 микролитрах стерильной дистиллированной воды. Затем смешайте 50 микролитров MSP, одну обработанную ДНК с двумя микролитрами 20 микромольного линкерного олигонуклеотида L и одним микролитром 20 микромольного олигонуклеотида S, затем добавьте один микролитр стерильной дистиллированной воды и шесть микролитров буфера 10 XT с четырьмя ДНК-лигаза.

Покройте смесь жидким воском. Денатурируйте олигонуклеотиды при температуре 50 градусов Цельсия в течение одной минуты и дайте им постепенно остыть до 10 градусов Цельсия с градиентом 0,5 градуса Цельсия в минуту. С помощью термоамплификатора добавьте в один микролитр 400 единиц на микролитр Т четыре ДНК-лигазы и инкубируйте реакцию при температуре 15 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день очистите линкерную лигированную ДНК с помощью набора для быстрой очистки ПЦР kaya и разбавьте 50 микролитрами стерильной дистиллированной воды. Они выбирают праймер для конкретного участка ДНК, который будет исследован, для дальних взаимодействий. В этом примере Абель будет использоваться в качестве праймера или приманки.

Подготавливают очищенную ДНК для первого раунда ПЦР путем объединения одного микролитра очищенной ДНК с одним микролитром 20 микромолярного способного одного специфического праймера 46 56 и одним микролитром 20 микромолярного линкерного специфического праймера 29 63. Затем добавьте три микролитра трех x ClinTech, ДНК-полимеразу один коктейль, который предварительно был смешан с 32 P-D-C-T-P согласно письменному протоколу, с последующим добавлением трех микролитров стерильной дистиллированной воды. После завершения цикла ПЦР проводят амплификацию с использованием термического цикла ПЦР с горячим запуском, описанного в письменном протоколе.

Очистите продукты первого раунда ПЦР с помощью набора для быстрой очистки ПЦР kaya Elute в 30 микролитрах стерильной дистиллированной воды. Используйте один микролитр первого препарата для ПЦР, разведенного в 100 раз, для проведения второго раунда ПЦР с использованием вложенных праймеров, добавив один микролитр 20 микромолярных способных одного специфического праймера, 46 26 и один микролитр 20 микромолярного линкерного специфического праймера. 29 61.

Снова добавьте три микролитра трех х КлинТех, ДНК-полимеразу, один коктейль и три микролитра стерильной дистиллированной воды. Проведите второй раунд ПЦР с использованием графика термоциклирования из 25 циклов при температуре 95 градусов Цельсия в течение 20 секунд. 67 градусов Цельсия в течение 40 секунд и 72 градуса Цельсия в течение одной минуты, с последующим продлением до 72 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Визуализируйте продукты ПЦР с помощью 5%-ного геля на странице мочевины, а затем отсканируйте экспонированный экран в фосфо-имиджоре. Каждая полоса ПЦР может быть переработана из геля путем растворения гелевых полосок в пробирке эйнора, содержащей 60 микролитров стерильной дистиллированной воды, и инкубации при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Центрифуга. Растворенные гелевые продукты кратковременно при 10 000 об/мин в течение 10 секунд.

Собрать все образцы. Удалите один микролитр для использования в качестве матрицы ДНК для проведения ПЦР с первичной репарацией. 29 61 46 26.

Используя те же условия, что описаны выше, после очистки и секвенирования можно провести анализ с помощью онлайн-инструмента для определения местоположения хромосомы. Оказавшись на сайте биоинформатики генома, нажмите blatt, чтобы создать новое окно, и вставьте последовательность ДНК. После отправки последовательности ДНК появятся результаты поиска BLATT.

Нажмите на кнопку браузера с функцией 100%identity, чтобы узнать местоположение последовательности ДНК. Эта область была использована в качестве приманки для определения ее дальнодействующих взаимодействий с ДНК. Два BGL два сайта и один BAM H один сайт были выбраны для анализа A CT во втором раунде набора ПЦР-праймеров, 46 26 29 61 был использован для амплификации способного M1 46,30 29 61 был использован для способного M два и 46, 36 29 61 был использован для способного M три.

Типичный гелевый узор показывает от одной до нескольких полос, как показано здесь для способного M1, для способного M два и для способного M три. Показано, что последовательность ДНК клонированного M1 демонстрирует, что каждый фрагмент из анализа A CT состоит из двух объединенных сегментов ДНК. Один сегмент происходит из области ДНК приманки, а второй сегмент — из ассоциированного партнера.

Сегменты соединены друг с другом первой последовательностью узнавания фермента рестрикции. Вторая последовательность узнавания фермента появится в конце связанной с ней последовательности-партнера. Клонированный фрагмент Able M1 содержит ДНК из области ABLE one, расположенной на девятой хромосоме Q 32.4, а ассоциированный партнер расположен на хромосоме 3 P 3, которая была идентифицирована как proc two.

Аналогичным образом, ассоциированный партнер M two был локализован в хромосоме 5 Q 21.1, в то время как клонированный партнер M three был идентифицирован как внутрихромосомная ассоциация вблизи локуса ABLE one, в отличие от трех анализов C. Методология, описанная в этом видео, будет выбрана для наиболее распространенных взаимодействий на большом расстоянии. Однако, увеличивая количество R-циклов ПЦР, можно выявить и дополнительные, менее частые ассоциации, используя импринтинг и контрольную область или ICR в двух локусах H 19 ИФР в качестве приманки ДНК в клетках фибрбластов мыши, различные программы циклирования применялись в первом и втором раундах ПЦР в анализе А КТ.

Анализ КТ А также может быть использован для выявления различий в ядерной архитектуре и дальнодействующих взаимодействиях между нормальными клетками и раковыми клетками. Нормальную ткань толстой кишки и ткань рака толстой кишки гомогенизировали, и анализ А КТ проводили в соответствии с процедурами, описанными в настоящем документе. Здесь показана структура ДНК области ICR в локусе IGF two H 19 и гене IGF two dpn.

Два участка для анализа А КТ помечены праймерами, используемыми во втором раунде ПЦР, помечены стрелками и цифрами разными цветами. Гелевый рисунок анализа А КТ представляет собой результаты ПЦР с использованием праймера 29 61 с парой праймеров 41, 61, 41 63, 51 45 и 51 51. Уникальные полосы, которые появляются только в нормальной ткани толстой кишки, помечаются желтыми стрелками, а те полосы, которые появились только в ткани рака толстой кишки, помечаются красными стрелками После его развития.

Этот метод открывает исследователям в области биологии рынка путь к изучению ядерной архитектуры и регуляции генов в трехмерном пространстве.