Безоперационное эндотрахеальном введении мышей с анализа легких и легочных Слив лимфатических узлов методом проточной цитометрии
2 мая 2011 г.
Проиллюстрируем нехирургических доставки тестовых материалов в легких мышей под наркозом через трахею. Этот метод позволяет легкого воздействия бактериальных и вирусных патогенов, цитокины, антитела, бусы, химических веществ или красителей. Мы также описать уборки и обработки легких и легких дренаж лимфатических узлов (LDLNs) для проточной цитометрии.
Общая цель данной процедуры заключается в нехирургическом введении исследуемого материала в легкие мышей с помощью зонда для гаважа с последующим анализом легких и дренирующих их лимфатических узлов. Для этого сначала вводят освещающий ларингоскоп и изогнутую иглу для гаважа в трахею мыши, находящейся под наркозом. Затем исследуемый материал вводят в легкие животного через ларингоскоп и иглу для гаважа.
Затем извлекают легкие и дренирующие лимфатические узлы. В завершение легкие и лимфатические узлы обрабатывают для получения суспензий одиночных клеток. В конечном итоге данный метод позволяет с помощью проточной цитометрии проанализировать взаимодействие исследуемого материала с иммунными клетками легких, а также миграцию клеток в дренирующие лимфатические узлы легких.
Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как интраназальное и аэрозольное воздействие, является возможность направленной доставки исследуемого материала в легкие в обход назально-ассоциированной лимфоидной ткани. Кроме того, она проще в исполнении, чем хирургическое введение вещества в трахею крыс. Процедуру продемонстрируют Элизабет Энти, постдок из лаборатории Ричи, и Манджи, аспирант из лаборатории Ленса.
После анестезии мыши приготовьте инокулят в 50 µL физиологического раствора. Наполните одномиллилитровый шприц, оснащенный стерильной изогнутой иглой для зондирования, инокулятом. Введите в шприц воздушный пузырь объемом 100 µL за инокулятом, чтобы обеспечить полное введение жидкости в легкое.
Поместите мышь на наклонную деревянную платформу, чтобы она закрепилась резцами за проволоку, и аккуратно зафиксируйте ее на месте с помощью ленты. Затем одной рукой включите ларингоскоп, а другой возьмите тупоконечные щипцы. Используя кончик ларингоскопа и щипцы, осторожно раскройте ротовую полость.
Вытяните язык и отведите его в сторону. Направьте лезвие ларингоскопа к задней части ротовой полости. Осторожно прижимайте ларингоскоп вниз под углом 90 градусов до тех пор, пока не станет видно отверстие трахеи.
Удерживая ларингоскоп одной рукой, возьмите в другую руку одномиллилитровый шприц с изогнутой иглой для зондирования, содержащий инокулят. Введите иглу в трахею до тех пор, пока изгиб иглы не окажется на уровне передних резцов. Равномерно нажмите на поршень, чтобы ввести инокулят, избегая образования пузырьков.
Как можно скорее извлеките иглу из трахеи. Удерживайте мышь в вертикальном положении в течение нескольких секунд, чтобы инокулят попал в легкие при вдохе. Поместите мышь рядом с heating lamp и дождитесь ее пробуждения.
После эвтаназирования закрепите лапы мыши на диссекционной доске с помощью булавок. Ножницами сделайте надрез вдоль средней линии вентральной стороны. Осторожно оттяните кожу, чтобы обнажить брюшину.
Сделайте надрезы на брюшине, чтобы обнажить органы брюшной полости. Зафиксируйте кончик грудины пинцетом и проколите диафрагму ножницами. Разрежьте диафрагму вдоль ребер, удерживая ножницы параллельно поверхности препарирующего лотка.
Сделайте небольшие разрезы грудной полости вдоль дорсовентральной линии с обеих сторон. Приподнимите грудную клетку с правой стороны от сердца. Под тимусом найдите два лимфатических узла.
Третий, чуть более крупный лимфатический узел расположен под небольшим артериальным сосудом, проходящим перпендикулярно трахее. Поместите извлеченные лимфатические узлы в 1 мл раствора для дигестии лимфоузлов, перемешайте и поставьте на лед. После извлечения лимфатических узлов извлеките легкие в планшет на шесть лунок.
Держа шестилуночный планшет на льду, аспирируйте PBS и измельчите доли органов на мелкие части с помощью пинцета и ножниц. Зафиксируйте каждый лимфатический узел иглой 26-го калибра и разделите его второй иглой 26-го калибра. Чтобы обеспечить высвобождение всех клеток, добавьте 3 мл смеси для переваривания легких и 1 мл для лимфатических узлов.
После инкубации лимфатических узлов в течение 25–30 минут, а легких — в течение 30 минут при 37 °C, добавьте ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ в каждую из смесей для переваривания, чтобы остановить реакцию, а затем поместите их на лед. С помощью шприца объемом 3 мл пропустите фрагменты легких через иглу 18-го калибра. Трижды протрите фрагменты легких и лимфатических узлов через клеточные сита с размером пор от 70 до 100 мкм.
Используя тыльную часть поршня шприца объемом 1 мл, промойте сеточки для фильтрации клеток 10 мл HBSS без кальция и магния. Центрифугируйте образцы клеток при 500 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Ресуспендируйте осадки в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте в течение трех минут.
При комнатной температуре добавьте 10 мл HBSS без кальция и магния для прекращения лизиса, затем центрифугируйте образцы при 500 ×g в течение пяти минут. Доведите объем суспензий одиночных клеток легкого и лимфатических узлов, дренирующих легкое, до 10 мл и 5 мл соответственно. Для подсчета клеток используйте исключение трипановым синим в камере Горяева.
На этих двух рисунках мышам линии AJ вводили 1 × 10⁸ спор Bacillus anthracis, после чего через 30 минут после инфицирования проводили анализ легких с помощью проточной цитометрии. На данных диаграммах рассеяния представлена стратегия гейтирования. На этих панелях показан процент CD45-положительных CD11c-положительных клеток легких, которые являются положительными по спорам Bacillus anthracis.
На данном рисунке представлены результаты анализа лимфатических узлов, дренирующих легкие у мышей линии AJ после внутритрахеального введения препаратов. На репрезентативных диаграммах рассеяния показан процент клеток CD 11 C high в лимфатических узлах, дренирующих легкие, содержащих флуоресцентные микросферы, по отношению к пустому каналу. На левой панели представлены результаты для мышей, которым вводили PBS, а на правой панели — результаты для мышей, которым вводили 5×10⁹ ярко-желто-зеленых микросфер с 10 µg LPS.
Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в этой области, такие как то, какие события инициируются непосредственно в легких и каким образом вдыхаемые антигены транспортируются из легких в дренирующие лимфатические узлы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается нехирургический метод введения исследуемых материалов в легкие обезболенных мышей через трахею. Этот метод позволяет воздействовать различными веществами и облегчает последующий анализ иммунных клеток легких.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Биология дыхания
Теоретические основы
- Понимание иммунного ответа легких имеет решающее значение для разработки методов терапии.
- Традиционные методы могут включать инвазивные процедуры.
- Данный метод позволяет проводить тестирование более безопасно и эффективно.
- Проточная цитометрия является ключевым инструментом для анализа взаимодействий иммунных клеток.
Цель исследования
- Разработать нехирургический метод воздействия тестовых материалов на легкие.
- Проанализировать взаимодействие тестовых материалов с иммунными клетками легких.
- Изучить миграцию иммунных клеток в дренирующие лимфатические узлы легких.
Используемые методы
- Введение освещающего ларингоскопа и изогнутой иглы для зондирования в трахею.
- Инстилляция исследуемого материала в легкие через ларингоскоп.
- Извлечение легких и дренирующих лимфатических узлов.
- Обработка тканей для получения суспензий единичных клеток для анализа.
Основные результаты
- Успешная доставка различных тестовых материалов в легкие.
- Облегчение проведения проточного цитометрического анализа иммунных клеток легких.
- Получение данных о миграции иммунных клеток в лимфатические узлы.
- Демонстрация неинвазивного подхода для исследований легких.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследований легких.
- Он расширяет понимание иммунных ответов в легких.
- Этот подход может привести к совершенствованию терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный нехирургический метод интратрахеального введения позволяет точно доставлять исследуемые материалы непосредственно в легкие, исключая влияние факторов верхних дыхательных путей. Метод способствует снижению рисков при изучении механизмов в области иммунологии и разработки респираторных препаратов, обеспечивая количественный анализ транспорта антигенов и взаимодействия иммунных клеток. Данный подход повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и определении релевантности доклинических моделей для ингаляционных терапевтических средств и вакцин.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем изоляции иммунных ответов, специфичных для легких, от влияния лимфоидной ткани, ассоциированной с носовой полостью.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимую доставку антигенов или соединений в легкие для последовательной оценки взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней, участвующих в путях презентации антигена и активации Т-клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные проточной цитометрии о взаимодействии исследуемого материала с иммунными клетками легких и его миграции в дренирующие лимфатические узлы.
- Практическая ценность: стандартизирует процесс обработки тканей для получения суспензий единичных клеток с целью высокопроизводительного иммунофенотипирования.
- Готовность анализа: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующего скрининга иммуномодуляторов или вакцинных кандидатов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: моделирует воздействие антигена на легкие человека и миграцию иммунных клеток в лимфатические узлы для проведения доклинических испытаний эффективности.
- Механистическое снижение рисков: проясняет причинно-следственные связи между воздействием на легкие и активацией иммунитета, уменьшая неопределенность в отношении механизма действия мишени.
- Продвижение с поправкой на риск: позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе количественных данных о трафике иммунных клеток из легких в лимфатические узлы.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум открытий: от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических иммунологических исследований, в особенности для ингаляционных биопрепаратов и малых молекул.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о специфическом для легких иммунном ответе и уточнение путей активации антигенпрезентирующих клеток.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать анализ и получать воспроизводимые количественные данные для сравнения иммуногенности исследуемых материалов.
- Аналитика: Предоставляет данные проточной цитометрии об ассоциированном с клетками антигене и кинетике миграции для проведения сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает иммунные события в легких с доклинической валидацией через миграцию в лимфатические узлы, способствуя разработке биомаркеров.
- Корпоративное использование: Создает многоцелевую платформу для изучения воздействия на легкие, применимую в программах по иммунологии, инфекционным заболеваниям и респираторной терапии.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в иммунных ответах легких.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов по экспозиции легких и иммунному анализу.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних стадиях в иммунологических пайплайнах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов с поправкой на риск на основе данных о специфическом для легких иммунном траффикинге и взаимодействии с мишенью.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области анестезии мышей, хирургической подготовки и препарирования тканей для обеспечения стабильного доступа к трахее.
- Зависимость от наличия оборудования для ларингоскопии, изогнутых игл для зондирования и стерильных материалов для инокуляции для надежного введения препарата.
- Необходимость использования стандартизированных протоколов переваривания тканей и проточной цитометрии всеми группами исследователей для воспроизводимого иммунного профилирования.
- При адаптации метода следует учитывать возможные изменения объема инокулята и времени переваривания тканей в зависимости от линии мышей или модели заболевания.
- Практические ограничения включают зависимость от технического навыка визуализации трахеи и возможную вариабельность распределения инокулята.
