Безоперационное эндотрахеальном введении мышей с анализа легких и легочных Слив лимфатических узлов методом проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы нехирургически еще не вживлять материал в легкие мышей с помощью иглы для зондажа и впоследствии анализировать легкие и дренирующие легкие лимфатические узлы. Это достигается путем введения сначала осветляющего ларингоскопа и изогнутой иглы в трахею мыши, находящейся под наркозом. Затем испытуемый материал закапывается в легкие животного с помощью ларингоскопа и иглы для зондажа.

Далее удаляются легкие и дренирующие лимфатические узлы. Наконец, легкие и лимфатические узлы перерабатываются в одиночные клеточные суспензии. В конечном счете, этот метод облегчает проточный цитометрический анализ ассоциации исследуемого материала с иммунными клетками легких и транспортировки клеток в дренирующие легкие лимфатические узлы.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как интраназальное и аэрозольное воздействие, заключается в том, что она позволяет направленно доставлять исследуемый материал в легкие в обход носовой ассоциированной лимфоидной ткани. Кроме того, он прост в выполнении по сравнению с хирургическими крысами или при установке трахеи. Демонстрировать процедуру будут Элизабет Энти, постдок в лаборатории Ричи, и Манджи, аспирант в лаборатории линз.

После обезболивания мыши приготовьте инокулюм в 50 микролитрах физраствора. Наполните инокулюм одномиллилитровый шприц, оснащенный стерильной изогнутой иглой для зондажа. Загрузите в шприц воздушный карман объемом 100 микролитров за инокулюмом, чтобы убедиться, что вся жидкость попала в легкое.

Поместите мышь на наклонную деревянную платформу, подвешенную за ее резцы на проволоке и аккуратно зафиксируйте ее на месте куском ленты. Затем включите ларингоскоп одной рукой, а другой рукой возьмитесь за пару тупых щипцов. С помощью кончика ларингоскопа и щипцов осторожно откройте рот щипцами.

Вытяните язык наружу и придерживайте его в сторону. Направьте лезвие ларингоскопа к задней части рта. Держите ларингоскоп прижатым очень осторожно под углом 90 градусов до тех пор, пока не станет видно отверстие трахеи.

Удерживая ларингоскоп на месте одной рукой, другой рукой возьмите один миллилитровый шприц, снабженный изогнутой иглой для зонда, содержащей инокулюм. Вводите иглу в трахею до тех пор, пока изгиб иглы не окажется у передних резцов. Равномерно нажмите на поршень, чтобы подать инокулянт без пузырей.

Как можно скорее вытяните иглу из трахеи. Держите мышь в вертикальном положении в течение нескольких секунд, чтобы инокулюм мог вдохнуть в легкие. Поместите мышь рядом с нагревательной лампой и дайте ей проснуться.

После усыпления приколите руки и ноги мыши к доске для вскрытия. Сделайте разрез по середине брюшной стороны ножницами. Аккуратно потяните кожу и обнажите брюшину.

Делайте надрезы на брюшине, чтобы обнажить органы брюшной полости. Возьмитесь за кончик грудины щипцами и проколите диафрагму ножницами. Разрежьте диафрагму по бокам грудной клетки ножницами параллельно поверхности доски для вскрытия.

Разрежьте грудную полость вдоль дорсальной вентральной линии с обеих сторон слегка. Поднимите вверх грудную клетку с правой стороны сердца. Прямо под тимусом ищите два лимфатических узла.

Третий, немного больший лимфатический узел, расположен под небольшим артериальным кровеносным сосудом, который проходит перпендикулярно трахее. Соберите лимфатические узлы в один миллилитр для переваривания лимфатических узлов, перемешайте и положите на лед. После забора лимфатических узлов соберите легкие в шестилуночную пластину.

Удерживая шестилуночную пластину на льду, аспирируйте PBS и измельчите доли на мелкие кусочки с помощью щипцов и ножниц. Удерживайте каждый лимфатический узел иглой 26 калибра и раздразните его второй иглой 26 калибра. Чтобы обеспечить высвобождение всех клеток, добавьте три миллилитра смеси для пищеварения для легких и один миллилитр для лимфатических узлов.

После инкубации лимфатических узлов в течение 25-30 минут и легких в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия добавьте ЭДТА до конечной концентрации 10 миллимоляров в каждую из смесей для пищеварения, чтобы остановить реакцию, а затем поместите их на лед. С помощью трехмиллилитрового шприца пропустите кусочки легких через иглу 18 калибра. Трижды разомните кусочки легких и лимфатических узлов через клеточные фильтры размером от 70 до 100 микрон.

С помощью задней части поршня шприца объемом один миллилитр промойте сетчатые фильтры 10 миллилитрами HBSS без кальциевых и магниевых центрифуг. Клетка отбирает образцы при 500-кратной гравитации в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Риз сгибает гранулы в пяти миллилитрах лизиса эритроцитов, буферизует и инкубирует в течение трех минут.

При комнатной температуре добавьте 10 миллилитров HBSS без кальция и магния, чтобы погасить лизис, центрифугируйте образцы при 500-кратной гравитации в течение пяти минут. Доведите до легкого и легкие, дренируя лимфатические узлы, одноклеточные суспензии до 10 миллилитров и пяти миллилитров соответственно. Используйте триамное синее исключение в гемоцитометре для подсчета клеток.

На этих двух рисунках мышам AJ вводили споры базиллы от 10 до восьмой, а легкие анализировали с помощью проточной цитометрии через 30 минут после заражения. Эти точечные диаграммы показывают стратегию стробирования. Эти панели показывают процент CD45-положительных CD-11 C-положительных клеток легких, которые являются положительными на споры сибирской язвы Bacillus.

На этом рисунке мышам с синдромом Эй-Джея вводили внутритрахеально, а затем анализировали их легкие дренирующие лимфатические узлы. Репрезентативные точечные диаграммы показывают процент клеток с высоким содержанием CD 11 C в дренирующих легкие лимфатических узлах, которые содержат флуоресцентные шарики, нанесенные на фоне пустого канала. На левой панели показаны результаты от мышей, которым вводили PBS, а на правой панели показаны результаты от мышей, которым вводили 5 раз по 10 до девяти флор, ярко-желтых зеленых микросфер с 10 микрограммами ЛПС.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в этой области, например, какие события конкретно инициируются в легких и как вдыхаемые антигены доставляются в дренажные лимфатические узлы из легких.