Визуализация MG53-опосредованной клеточной мембраны Ремонт Использование В естественных условиях И В пробирке Системы

Общая цель данной процедуры заключается в оценке способности к восстановлению мембраны как в организме животного, так и в изолированных клетках. Изолированные волокна скелетных мышц собирают и помещают в среду, содержащую краситель FM 1 43. Затем с помощью УФ-лазера облучают и повреждают участок клеточной мембраны, чтобы обеспечить проникновение красителя внутрь клетки.

Изолированные клетки трансфецируют плазмидной ДНК, экспрессирующей GFP MG 53, который локализуется в плазматической мембране и цитозоле клетки. Затем кончик микроэлектрода вводят в мембрану C two C 12 для нанесения повреждения. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие транслокацию GFP MG 53 в место повреждения.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку для освоения техники проникновения микроэлектрода и изоляции мышечных волокон требуются определенные практические навыки. Процедуру продемонстрируют доктор Лин, менеджер нашей лаборатории, доктор Вазу, постдок Мэтт Оранж, аспирант, и доктор Шаза, профессор-исследователь нашего отделения. Для начала поместите под беговую дорожку лоток или синий лабораторный коврик, чтобы собирать отходы жизнедеятельности животных во время эксперимента.

Затем установите угол наклона поверхности беговой дорожки. Некоторые беговые дорожки оснащены встроенным механизмом регулировки наклона, в то время как другие требуют приподнимания дорожки иными способами. Обычно используется плоская поверхность или угол наклона от 7 до 15 градусов вниз или вверх.

Проведите акклиматизацию мышей, поместив их на беговую дорожку при выключенной электрической сетке и включенном двигателе приводного ремня; после 15-минутного периода акклиматизации включите стимулирующую электрическую сетку. Запустите беговую дорожку с начальной скоростью примерно пять метров в минуту. Увеличивая скорость на один-два метра в минуту каждую минуту, обеспечьте животному пятиминутный период разминки.

Повторяйте этот период разминки ежедневно в течение от 3 до 10 дней, чтобы повысить прилежность животных во время тестирования. Для проведения теста на острое истощение при физической нагрузке постепенно увеличивайте скорость беговой дорожки до достижения максимальной и следите за признаками истощения.

Животное считается истощенным, если оно проводит более половины времени вне беговой дорожки или остается на сетке более пяти секунд подряд. Удалите истощенную мышь и зафиксируйте общее время бега. Тренировка на выносливость.

Протоколы бега начинаются с одной и той же процедуры разминки. Однако максимальная скорость обычно ниже, а время бега может быть довольно длительным. После завершения тестирования верните мышей в домашние клетки и очистите беговую дорожку 70% ethanol.

Изолируйте поверхностный слой короткого сгибателя пальцев стопы для дальнейшего анализа. Сначала сделайте разрез кожи подошвы по срединной линии, стараясь не повредить подлежащую мышцу. Затем сделайте горизонтальные разрезы и удалите кожу.

Найдите плоское белое сухожилие мышцы FDB, прикрепленное к пяточной кости. С помощью пинцета отделите, а затем перережьте сухожилие близко к месту прикрепления. Осторожно потяните сухожилие вверх, удаляя при этом любые соединительные ткани.

Найдите место, где дистальные сухожилия разделяются на отдельные пальцы. Перережьте сухожилия в месте их прикрепления к более глубокому слою мышц и удалите FDB. Поместите пучок мышцы FDB в один миллилитр раствора коллагеназы, предварительно нагретого до 37 °C.

Закрепите пробирку горизонтально на орбитальном шейкере при температуре 37 °C и перемешивайте при 200 об/мин в течение 65 минут. Признаком достаточного переваривания является появление рыхлой структуры и бледного цвета. Отрежьте кончик наконечника дозатора объемом 1 мл, чтобы переваренный пучок мог пройти сквозь него.

Аккуратно перенесите пучок в центрифужную пробирку, содержащую около 600 µL 2.5. Calcium tyro. Осторожно переверните пробирку, чтобы отделить свободные волокна от пучка.

Затем обрежьте кончик наконечника дозатора объемом 30 µL так, чтобы его диаметр был лишь немного меньше диаметра пучка мышц. Используйте этот наконечник, чтобы втянуть пучок в него, а затем вытолкнуть обратно в раствор. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока большая часть волокон не отделится от пучка.

Перемешайте разделенные волокна, осторожно вращая пробирку. Отберите необходимый объем и перенесите его в чашку delta T с стеклянным дном. Оставшиеся волокна храните при температуре four degrees Celsius примерно шесть часов для дальнейшего использования и дополнительных исследований.

Оставьте чашку в покое на пять минут. Это позволит волокнам прикрепиться к стеклянному дну чашки. Поместите чашку со стекляным дном на конфокальный микроскоп, оснащенный УФ-лазером.

Рассмотрите волокна с помощью фазово-контрастной микроскопии при увеличении более 100 x, чтобы проверить наличие нормального рисунка поперечной исчерченности и прямой стержневидной формы. Добавьте в раствор красители стирилперидин FM 1-43 или FM 4-64 до конечной концентрации 2,5 мкМ. Расположите волокно под углом 45 градусов от верхнего левого до нижнего правого угла поля зрения для нанесения повреждения.

Облучите область плазматической мембраны размером пять на пять пикселей. При использовании УФ-лазера, настроенного на максимальную мощность в течение пяти секунд, облучаемый участок должен разделить плазматическую мембрану так, чтобы половина квадрата пять на пять находилась внутри волокна, а остальная часть — снаружи. Снимайте изображения проникновения красителя в волокно с интервалом в пять секунд в течение пяти минут. В одной чашке можно облучать не более трех волокон, так как флуоресцентный краситель со временем подвергнется эндоцитозу в волокно, что затруднит анализ данных.

После использования трех волокон следует подготовить новый планшет. С помощью программного обеспечения для анализа рассчитайте изменение интенсивности флуоресценции на области площадью примерно 200 square microns для сравнения между волокнами. Для каждого кадра должен быть произведен следующий расчет: delta F, деленное на F zero, где F zero — это средняя флуоресценция интересующей области в первом захваченном кадре, а delta F — изменение флуоресценции в каждом последующем кадре.

Используйте стандартные методы для трансфекции клеток плазмидной ДНК, экспрессирующей GFP MG 53. Затем подготовьте микропипетки. Установите капилляр Pyrex на микропипетку.

Выполните вытяжку по предустановленной программе. Закрепите микропипетку в трех осевом микроманипуляторе. Удалите среду из чашки delta T и замените ее буфером с тирозином и 2.5 мМ кальция.

Поместите чашку с трансфецированными клетками на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с масляным иммерсионным объективом 40 x 1.3 NA. Вызовите острое повреждение живой клетки, введя микропипетку в клеточную мембрану, а затем быстро извлекая ее из клетки. Выполните серию последовательных снимков живой клетки с интервалом 1,54 секунды на кадр для регистрации разрыва мембраны, индуцированного тропонином.

ПЕРЕНОСИЛИ 0,005% тропонина со скоростью приблизительно один миллилитр в минуту непосредственно над визуализируемой клеткой. Беговая дорожка может быть использована для измерения снижения беговой способности. У мышей с нокаутом MG 53, показанных здесь, наблюдается снижение беговой способности из-за повреждения скелетных мышц.

Степень повреждения, вызванного УФ-лазером, зависит от способности к репарации мембраны наблюдаемого волокна. Здесь представлено волокно нормальной мыши до нанесения повреждения. Данное изображение было получено спустя 200 секунд и демонстрирует незначительное повреждение.

Мышечное волокно, полученное от мышей с нокаутом MG 53, у которых нарушена способность к восстановлению мембраны, будет демонстрировать более значительное проникновение красителя после нанесения повреждения. Вот пример неповрежденной миотрубки C2C12, трансфицированной GFP MG 53. Стрелка на этом изображении указывает на везикулы, содержащие GFP MG 53, которые перемещаются к местам повреждения.

В данном примере для повреждения плазматической мембраны использовался сапонин. Обратите внимание на транслокацию GFP MG 53 из цитозоля к клеточной мембране после повреждения. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости выделения качественных мышечных волокон с гладкими сарколеммами и четким рисунком поперечной исчерченности.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать способность к восстановлению мембраны в мышечных клетках и в соответствующих клеточных культурах.