Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Общей целью данного эксперимента является получение множественных макрофагальных культур из смешанных первичных культур клеток печени крыс без необходимости использования сложного оборудования или навыков. Это достигается, во-первых, путем диссоциации клеток печени взрослых крыс с помощью перфузии коллагеназы с последующим выделением фракции клеток паренхиматозных гепатоцитов. Затем клетки инкубируют в колбах с культурами тканей T 75 с питательной средой для получения смешанных первичных культур клеток печени.

Затем, после 10-12 дней культивирования, колбы с культурой встряхивают, чтобы облегчить перенос макрофагов в пластиковые чашки, из которых их затем собирают путем селективной адгезии после короткого инкубационного периода. Наконец, более 10 из шести клеток могут быть повторно собраны из одних и тех же колб с культурой тканей T 75 с интервалом в два-три дня в течение более чем двух недель. Методы выделения макрофагов печени хорошо описаны.

Тем не менее, большинство предыдущих методов требуют сложного оборудования, такого как центробежный иллюстратор, и отточенных технических навыков. В данной работе мы представляем простой и новаторский метод получения макрофагов печени в достаточном количестве и чистоте из смешанных первичных культур взрослых обернутых клеток печени, не требующий специального оборудования или передовых лабораторных навыков. Вскрытие животных, перфузия печени и подготовка цитов продемонстрируют врачи Норко, Яманака и Мико Ёсиока в Национальном институте здоровья животных.

Затем выделение и очистка макрофагов печени от культурных рисков покажет доктор Такето Такено в Национальном институте агробиологических наук. Итак, приступим. Для подготовки к обильному размножению печени крысы начинают с предварительного нагрева одного флакона моющего раствора и одного флакона раствора коллагеназы.

Затем, после подтверждения седативного эффекта с помощью щипкового щипка кожи, поместите взрослого самца крысы под наркозом в кастрюлю из нержавеющей стали и распылите 70% этанола на его брюшную полость и грудную клетку. Далее сделайте небольшой надрез посередине живота ножницами для рассечения и снимите кожу. Затем вскройте ножницами живот и подтвердите расположение воротной вены.

Далее пропустите хирургическую нить под воротную вену и слабо затяните нить. Затем зажмите дистальную часть нижней ванокальной полости и брыжеечную вену комарным зажимом, чтобы предотвратить рефлюкс крови в печень. Вскройте грудную полость, разрезав ножницами диафрагму, и обнажите сердце, сделав небольшой разрез в воротной вене офтальмологическими ножницами, вставьте в вену двухмиллиметровый пластиковый катетер и плотно затяните нить вокруг катетера.

Загрузите в перфузионную систему подогретый раствор для умывания, а затем подключите ее к катетеру. Начинают перфузию в С 2 со скоростью 10 миллилитров в минуту. В это же время сделайте надрез в правой стене атриума с помощью препарирующих ножниц.

Продолжайте растушевку в течение 10 минут, затем переключите раствор для растущения на раствор коллагеназы и перфузируйте в течение 10-20 минут. Из расчета 10 миллилитров в минуту наполните стерильный стакан 25 миллилитрами раствора коллагеназы. Затем выньте и аккуратно поместите перфузную печень в стакан.

Измельчите печень на небольшие кусочки ножницами. Добавьте 75 миллилитров холодного MEM в полученную клеточную суспензию. После щадящего пипетирования отфильтруйте суспензию через клеточное сетчатое фильтр 100 микрометров.

Чтобы удалить соединительную ткань из непереваренных фрагментов ткани, соберите фильтрат в конические пробирки объемом 50 миллилитров. Перелейте фильтрат в конические пробирки объемом 50 миллилитров и промойте клетки четыре раза, сначала открутив клетки при 50 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. После обрыва осторожно выбросьте надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулу в холодном МЕМ и снова раскрутите ячейки после последней промывки.

Ресуспендируйте клетки печени в питательной среде. Теперь засейте клетки в 5-10 Т-75 тканевых колб с плотностью от 6,7 до 10 до 4 клеток на квадратный сантиметр. Поместите колбы с культурой в инкубатор и заменяйте питательную среду каждые два-три дня.

После одного дня культивирования паренхиматозные гепатоциты распространяются по поверхности колбы и демонстрируют типичную полигональную копаловую каменовидную морфологию с одним или двумя круглыми ядрами. В течение нескольких дней после культивирования паренхиматозные гепатоциты теряют свою морфологию эпителиальных клеток и превращаются в более уплощенные фибробластические клетки Примерно на шестой день фазового контраста, яркие круглые макрофагоподобные клетки начинают пролиферировать на клеточном листе фибробластов. Рост макрофагальных клеток достигает максимального уровня примерно на 12-й день.

Количество макрофагоподобных клеток уменьшается примерно на 19-й день, когда фибробластический клеточный лист начинает дегенерировать. Таким образом, примерно через 7-10 дней культивирования мы суспендируем макрофаги, которые пролиферировали на клеточном листе, в культуральную среду путем взаимного встряхивания колб с культуральными колбами в течение 30 минут после того, как макрофаги были ресуспендированы. Играйте на каждой из 100-миллиметровых пластиковых посуд, не содержащих тканевых культур, с помощью среды из двух колб T 75.

Наполните колбы с культурой питательной средой и верните их в инкубатор. Инкубируйте пластиковую посуду в течение 30 минут после инкубационного периода, вымойте посуду три раза, аспирировав среду, и осторожно промойте пластиковую посуду PBS, как показано здесь, уже через 10 минут после осаждения макрофагальных клеток, прикрепленных к поверхности чашки, в то время как другие загрязняющие фибробластические клетки остаются во взвешенном состоянии. После промывки PBS получают высокоочищенную популяцию макрофагов.

Как видно на этом рисунке, клетки приобретают типичную морфологию макрофагов после 40 минут культивирования, и часто наблюдаются митотические клетки, как показано стрелками. Чтобы собрать эту новую высокоочищенную популяцию макрофагов на один миллилитр, введите раствор LE Express в промытые клетки и поместите посуду обратно в инкубатор еще на 10 минут. По истечении этого инкубационного периода добавьте девять миллилитров питательной среды, а затем аккуратно соскребите прикрепленные макрофаги скребком для клеток и переложите в 15-миллилитровую коническую пробирку центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте один миллилитр питательной среды, диссоциируйте ресуспендированные клеточные скопления на отдельные клетки путем энергичного пипетирования, перечислите количество клеток с помощью гемоцитометра, как показано на этом графике, более 10 из шести клеток могут быть собраны из культуральной колбы T 75 повторно с интервалом в два-три дня в течение более двух недель, что позволяет получить общий выход клеток от 10 до 7 на 75 культур T. Как показано на этих изображениях, выделенные клетки иммуноокрашивают моноклональными антителами против макрофагов крыс, таких как CD 68 или ED one и CD 1 72 A или OX 41. Эти клетки обладали функциональными свойствами макрофагов, такими как активный фагоцитоз меченых FITC микрогранул.

В этом видео мы представили простой и эффективный метод получения макрофагов из смешанных первичных культур взрослых эритроцитов печени. Наша процедура не требует сложного оборудования или навыков, но обеспечивает достаточное количество чистых макрофагов, которые могут быть повторно собраны из одной и той же культуры латуни. Этот метод может быть применен и к другим видам млекопитающих.

Спасибо за просмотр видео и удачи в дальнейших экспериментах. Аплодисменты.