Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

Атомно-силовая микроскопия или AFM использует механическое зондирование поверхности для получения изображений высокого разрешения без необходимости химической обработки образца. В данном видео бактерии иммобилизируются на слюде с желатиновым покрытием и визуализируются в жидкой среде с помощью AFM. Сначала квадраты слюды вырезаются по размеру платформы микроскопа AFM. Верхний слой слюды удаляется, после чего квадраты слюды покрываются желатином.

Затем каплю бактериальной суспензии наносят на покрытую желатином слюду и распределяют по поверхности. С помощью наконечника пипетки образцы инкубируют в течение 10 минут. После этого несвязанные бактерии смывают с поверхности.

Образец помещают в жидкостную ячейку А FM и проводят сканирование для получения изображений живых бактерий с высоким разрешением. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как иммобилизация на пористых фильтрах ISO, является возможность надежной иммобилизации как палочковидных, так и сферических бактерий. Кроме того, зонду А FM доступна большая часть поверхности клетки.

Ключевым преимуществом атомно-силовой микроскопии по сравнению с другими методами микроскопии является возможность проведения исследований отдельных клеток, что позволяет изучать морфологию клеток, формирование септы и цитокинез. Новички в этом методе часто сталкиваются с трудностями, так как склонны использовать желатин, который не доказал свою эффективность в иммобилизации бактерий, или использовать бактерии, выращенные на сложных средах, компоненты которых препятствуют адгезии бактерий к поверхности желатина. Идея данного метода пришла к нам из экспериментов 1970-х годов, в которых применялась иммобилизация бактерий.

Стеклянные предметные стекла с желатиновым покрытием для экспериментов с использованием световой микроскопии и авторадиографии. В данной демонстрации живые грамотрицательные бактерии иммобилизируются для АСМ-визуализации, однако метод также применим к грамположительным бактериям. Чтобы подготовить слюду, обрежьте ее ножницами так, чтобы она соответствовала размеру предметного столика АСМ-микроскопа и позволяла разместить влажную кювету для АСМ.

Затем наклейте клейкую ленту на поверхность слюды и снимите ее, чтобы отслоить внешний слой слюды от вырезанного фрагмента. Продолжайте удалять внешний слой с обеих сторон, пока не останутся только гладкие целые слои. Для приготовления желатинового раствора налейте 100 milliliters дистиллированной воды в лабораторную бутыль и нагрейте ее в микроволновой печи.

Когда вода начнет закипать, извлеките ее из микроволновой печи, добавьте 0,5 г желатина и аккуратно встряхните флакон до полного растворения желатина. Обратите внимание, что говяжий желатин не подходит для данной процедуры. Рекомендуется использовать свиной желатин.

Поставьте флакон на лабораторный стол и дайте ему остыть до 60–70 °C. Затем перелейте достаточное количество желатинового раствора в небольшой стакан, чтобы квадрат MICA можно было полностью погрузить с помощью пинцета. Погрузите квадрат MICA в теплый желатиновый раствор и немедленно извлеките его.

Поместите MICA на ребро на бумажное полотенце, прислонив её к штативу для микроцентрифуги, для высыхания на открытом воздухе в течение ночи. MICA с желатиновым покрытием может использоваться в течение как минимум двух недель. Если MICA с желатиновым покрытием не будет использоваться в течение нескольких недель.

Поместите его на фильтровальную бумагу в закрытую чашку Петри и храните при комнатной температуре. Излишки раствора желатина можно хранить в холодильнике и использовать в течение примерно одного месяца, просто повторно нагрев исходный раствор до температуры от 60 до 70 °C. При повторном нагреве следует соблюдать осторожность, чтобы желатин не закипел.

Перед нанесением бактерий на MICA с желатиновым покрытием убедитесь, что концентрация бактерий достаточна. Используйте спектрофотометр для измерения оптической плотности образца бактерий при 600 нанометрах. Оптимальным значением OD является диапазон от 0.5 до 1.

Затем перенесите один миллилитр культуры в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте ее до образования осадка. С помощью пипетки удалите супернатант, после чего промойте осадок в одном миллилитре фильтрованной деионизированной воды или буфера. Осторожно перемешайте содержимое, несколько раз набирая и выпуская жидкость пипеткой для ресуспендирования.

Центрифугируйте полученный осадок и незамедлительно ресуспендируйте его в 500 µL деионизированной воды Nano Pure; бактериальная суспензия должна быть заметно мутной, чтобы обеспечить достаточную концентрацию клеток для Флуоресцентной микроскопии (FM).

Если есть опасения по поводу осмотического шока, в раствор для визуализации можно добавить 0,25 молярную сахарозу. Я ресуспендировал эти бактерии в воде, но не бойтесь пробовать другие жидкости. Например, мы проводили это с 0,25% сахарозой, поэтому попробуйте другие жидкости и проверьте, сработают ли они так же эффективно.

Подготовьте по два предметных стекла для каждого образца. С помощью микропипетки нанесите от 10 до 20 µL клеточной суспензии на поверхность, покрытую желатином. Затем, чтобы обеспечить достаточную площадь покрытия для FM-визуализации, используйте наконечник микропипетки для распределения капли по осям X и Y.

Инкубируйте образец в течение 10 минут при комнатной температуре, стараясь не касаться кончиком пипетки поверхности желатина. Затем промойте образец струей воды и удалите излишки жидкости, прикоснувшись краем образца к бумажному полотенцу или фильтровальной бумаге. Быстро высушите один из предметных стекол струей азота.

Затем визуально осмотрите предметное стекло. Наличие непрозрачного пятна указывает на то, что бактерии не были удалены на этапе промывки. Другое предметное стекло, которое теперь будет использоваться для визуализации, не должно высохнуть.

Поместите образец на мокрую стадию АСМ и закрепите его с помощью зажимов, затем с помощью микропипетки добавьте воду на мокрую стадию. Рекомендуется подготовить атомно-силовой микроскоп перед началом визуализации в жидкости. Убедитесь, что кантилевер для визуализации в жидкости установлен в АСМ и совмещен с лазером.

Перейдите к визуализации с помощью атомно-силовой микроскопии, используя атомно-силовой микроскоп pico plus, оснащенный 100-микронной сканирующей головкой и зондами vico из нитрида кремния с номинальной жесткостью от 0.01 до 0.1 нН/нм. После подготовки микроскопа установите в него FM-сканер и предметный столик. Обычно в качестве скорости сканирования мы выбираем диапазон от 0.5 до 1 линии в секунду, а разрешение устанавливается от 128 до 512 точек данных на линию.

Настройте прибор для сбора изображений с разрешением от 128 до 512 пикселей на линию. Выполняйте сканирование со скоростью от 0,5 до одной линии в секунду. Затем, при необходимости, отрегулируйте уставку и коэффициенты усиления в режиме A FM для получения оптимальных изображений.

Наконец, получите изображения. Бактерии E coli были закреплены на покрытой желатином слюдой (MICA), как описано в данном видео, после чего была выполнена съемка в 0.005 молярном PVS. Используя этот метод.

Скипетры отчетливо видны на полученном изображении, а поверхности клеток гладкие, без признаков дегидратации. Для сравнения: на изображениях тех же клеток e coli на воздухе, представленных здесь, часто видны структуры, которые не наблюдаются в жидкости. В данном случае клетки имеют кольцевидный вид из-за дегидратации, и видны бактериальные придатки, такие как FIA.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать образцы бактерий для FM-визуализации в жидкой среде. При должном навыке выполнение этой методики занимает около одного часа, если микроповерхности с желатиновым покрытием были подготовлены заранее. При выполнении данной процедуры важно выбрать подходящий желатин и обеспечить соответствующую концентрацию бактерий при следовании данной инструкции.

Возможны и другие измерения, например, использование кантилевера FN в качестве инструмента измерения силы для регистрации показателей силы на поверхности бактерий. Кроме того, к зонду A FM можно прикрепить специфические молекулы-зонды для взаимодействия с определенными мишенями на поверхности бактерий с целью идентификации и измерения сил взаимодействия. В целом, при работе с патогенными бактериями следует помнить, что при использовании данного метода необходимо всегда соблюдать меры предосторожности.