Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

Атомно-силовая микроскопия или FM использует механическое зондирование поверхности для получения изображений с высоким разрешением без необходимости химической обработки образца. В этом видео бактерии иммобилизуются на слюду, покрытую желатином, и визуализируются в жидкой среде с помощью FM. Сначала квадраты MICA вырезаются по размеру платформы FM-микроскопа. Верхний слой слюды удаляется, а квадраты слюды покрываются желатином.

Далее каплю бактериальной суспензии помещают на покрытую желатином слюду и размазывают. С помощью наконечника для пипетки образцы инкубируются в течение 10 минут. Затем несвязанные бактерии смываются с поверхности.

Образец помещают во влажную камеру A FM и визуализируют для получения изображений живых бактерий с высоким разрешением. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как мобилизация пористого фильтра ISO, заключается в том, что как палочкообразные, так и сферические бактерии могут быть надежно иммобилизованы. Кроме того, больший процент поверхности ячейки доступен для датчика A FM.

Ключевым преимуществом атомно-силовой микроскопии по сравнению с другими микроскопиями является то, что можно проводить исследования отдельных клеток, изучать морфологию клеток, формирование перегородки и проводить цитокинез. Люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что они, как правило, используют желатин, который не обладает доказанной способностью обездвиживать бактерии, или используемые бактерии, выращенные в сложной среде, где компоненты будут конкурировать с адгезией бактерий к поверхности желатина. Впервые идея этого метода пришла нам в руки в ходе экспериментов еще в 1970-х годах, когда бактерии были обездвижены.

Стеклянные стекла с желатиновым покрытием для экспериментов с использованием световой микроскопии и авторентгенографии. В этой демонстрации живые грамотрицательные бактерии иммобилизуются для FM-визуализации, но этот метод также применим к грамположительным бактериям. Чтобы приготовить слюду, начните с того, что разрежьте ее ножницами по размеру предметного столика микроскопа A FM и вместите мокрую ячейку A FM.

Далее положите скотч на поверхность СЛЮДЫ и снимите ее, чтобы снять внешний слой СЛЮДЫ с отрезанного кусочка. Продолжайте снимать внешний слой с обеих сторон, пока не останутся только гладкие непрерывные слои. Чтобы приготовить желатиновый раствор, добавьте в лабораторную бутылку 100 миллилитров дистиллированной воды и нагрейте ее в микроволновой печи.

Когда вода закипит, достаньте ее из микроволновки, добавьте 0,5 грамма желатина и аккуратно набухайте в бутылке, пока желатин не растворится. Обратите внимание, что бычий желатин не очень хорошо подходит для этой процедуры. Рекомендуется использовать свиной желатин.

Поставьте бутылку на столешницу и дайте ей остыть до 60-70 градусов по Цельсию. Затем налейте достаточное количество желатинового раствора в небольшой стакан, чтобы обеспечить полное погружение слюды с помощью щипцов. Погрузите квадратик слюды в теплый раствор желатина и быстро извлеките его. Немедленно.

Положите MICA на край на бумажное полотенце, прислонившись к штативу микроцентрифуги, чтобы высушить на окружающем воздухе в течение ночи. Покрытую желатином MICA можно использовать не менее двух недель. Если покрытая желатином слюда не будет использоваться в течение пары недель.

Поместите его на фильтровальную бумагу в закрытую чашку Петри и храните при комнатной температуре. Избыток желатинового раствора можно хранить в холодильнике и использовать в течение примерно месяца, просто нагревая исходный раствор до температуры от 60 до 70 градусов. По Цельсию необходимо следить за тем, чтобы желатин не закипел во время повторного нагрева.

Перед установкой бактерий на MICA с желатиновым покрытием убедитесь, что концентрация бактерий достаточна. Используйте спектрофотометр для получения показаний оптической плотности бактериального образца на глубине 600 нанометров. Оптимальным является ОР 0,5 к одному.

Затем переложите один миллилитр культуры в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте ее, чтобы гранулировать после центрифугирования. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, затем промойте гранулу в одном миллилитре фильтрованной деионизированной воды или буфера. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз до реанимации.

Приостановите центрифугу для пеллет и немедленно снова суспендируйте гранулу. В 500 микролитрах наночистой деионизированной воды бактериальная суспензия должна быть заметно загрязнена, чтобы иметь достаточную концентрацию клеток. Для FM-изображения.

Если вас беспокоит осмотический шок, в раствор для визуализации можно добавить 0,25 молярной сахарозы. Я ресуспендировал эти бактерии в воде, но не бойтесь пробовать другие жидкости. Например, мы сделали это с 0,25% сахарозы, поэтому попробуйте другие жидкости и посмотрите, сработает ли это так же.

Подготовьте по два слайда для каждого образца. С помощью микропипетки добавьте от 10 до 20 микролитров клеточной суспензии на поверхность, покрытую желатином. Затем, чтобы обеспечить достаточную площадь покрытия для FM-визуализации, используйте наконечник микропипетки, чтобы распределить каплю в направлении X и Y.

Стараясь физически не касаться поверхности желатина кончиком пипетки, инкубируйте образец в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее промойте струей воды лишнюю жидкость с образца, прикоснувшись краем образца к бумажному полотенцу или фильтровальной бумаге. Быстро высушите одну из горок с помощью струи газообразного азота.

Затем визуально осмотрите предметное стекло. Непрозрачное пятно указывает на то, что бактерии не были удалены на этапе промывки. Другому предметному стеклу, которое теперь будет использоваться для визуализации, нельзя давать высохнуть.

Поместите его в влажную сцену A FM и закрепите с помощью зажимов, с помощью микропипетки добавьте воду в влажную сцену. Хорошей идеей является подготовка атомно-силового микроскопа перед получением изображений в жидком состоянии. Убедитесь, что консоль для визуализации в жидкости помещена в FM A и выровнена с лазером.

Приступайте к получению изображений с помощью атомно-силовой микроскопии с помощью атомно-силового микроскопа pico plus, оснащенного сканирующей головкой 100 микрон, и зондами из нитрида кремния vico с номинальными пружинными постоянными в диапазоне от 0,01 до 0,1 наноньютона на нанометр. После того, как микроскоп будет подготовлен, вставьте FM-сканер и столик в микроскоп. Как правило, мы начинаем с 0,5 строк в секунду до одной строки в секунду в качестве скорости визуализации, а разрешение устанавливается от 1 28 точек данных на строку до 512.

Настройте инструмент на сбор изображений с использованием от 128 до 512 пикселей на линию. Сканирование со скоростью сканирования от 0,5 до одной строки в секунду. Затем, при необходимости, отрегулируйте заданное значение и усиление на A FM для достижения оптимальных изображений.

Наконец, соберите изображения. Бактерии E. coli были нанесены на покрытую желатином MICA, как описано в этом видео, а затем визуализированы в 0,005 молярного PVS. С помощью этого метода.

На собранном изображении хорошо видны скипетры, а поверхности клеток гладкие, без признаков обезвоживания. Для сравнения, изображения, сделанные с той же кишечной палочкой в воздухе, как показано здесь, часто показывают структуры, не видимые в жидкости. В этом случае клетки имеют кольцевой вид из-за обезвоживания, и могут быть видны бактериальные придатки, такие как FIA.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как подготовить бактериальные образцы для FM-визуализации в жидкой среде. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за один час, если микроповерхности с желатиновым покрытием были предварительно подготовлены. При попытке проведения этой процедуры важно выбрать правильный желатин и иметь соответствующую концентрацию бактерий после этой процедуры.

Могут быть выполнены и другие измерения, такие как использование кантилевера FN в качестве инструмента для измерения силы на бактериальных поверхностях. Кроме того, определенные молекулы зонда могут быть привязаны к наконечнику A FM для взаимодействия с конкретными мишенями на поверхности бактерии для идентификации и измерения сил взаимодействия. Как правило, не забывайте, что если вы работаете с патогенными бактериями, всегда необходимо соблюдать меры предосторожности при работе с этим методом.