Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы получить изображение биомолекул, таких как ДНК и белки, в водных буферах в режиме реального времени с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем предварительной подготовки биомолекул к визуализации. Затем настраивается атомно-силовой микроскоп и устанавливается свободнонесущий зонд FM.

Затем поверхность образца и представляющие интерес биомолекулы визуализируются и анализируются. В конечном счете, с помощью атомно-силовой микроскопии можно получить результаты, которые показывают общий размер, количество и организацию ДНК и белков и гетерогенных биомолекулярных комплексов в буферных условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярных шаперонов, например, какова STO-геометрия шаперонов и комплекса cos шаперонов для клиента.

Белок: Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как этапы подготовки зонда A FM и рычага Кента могут быть трудными для изучения из печатных инструкций, в основном из-за сложностей, связанных с их физическим манипулированием. Демонстрировать процедуру будут Морган Шеннон и Джон Герц, два студента из моей лаборатории. Для начала изолируют молекулы белка или ДНК, которые будут визуализированы, и суспензируют их в водном буфере. После подтверждения чистоты образца инкубируйте его в абсорбционном буфере FM на льду, чтобы стимулировать адгезию образца к слюде.

Для образцов белка используйте буфер с 10 миллимолярными кучами. А для ДНК магнийсодержащего буфера, состоящего из 10 мМ триса, рН 7,5 10 ммилляр натрия хлорида, двух миллимоляров хлорида магния подходит для монтажа A FM зонда. Поместите держатель зонда жидкостных ячеек на соответствующую консольную док-станцию.

Найдите длинный толстый кантилевер острого нитридного рычажного щупа, который будет использоваться для визуализации. Осторожно перенесите его в держатель зонда жидкостных ячеек, следя за тем, чтобы наконечник оставался в вертикальном положении. Затем осмотрите кантилевер под световым микроскопом, чтобы убедиться, что он не поврежден и правильно установлен в держателе зонда для жидких клеток.

Затем осторожно снимите FM-головку с инструментального узла типа «ласточкин хвост», затянув зажимной винт нейронной головки. Переверните FM-головку и с усилием надавите на держатель датчика жидкостных ячеек на четыре контакта в основании FM-головки. Наконец, осторожно верните головку FM в инструмент хвостового оперения.

Для дальнейшей подготовки FM перед получением изображений образцов перемещайте ручки встроенного светового микроскопа, чтобы найти кончик кантилевера, регулируйте стрелки вверх и вниз оптического контроллера в программном обеспечении, чтобы сфокусировать кончик кантилевера. С помощью ручек регулировки лазера выровняйте лазер по наконечнику кантилевера. Это один из самых технически сложных этапов в протоколе: позиционирование выполняется вручную и требует точной регулировки ручки.

Тщательный контроль лазера в пятне отражения и пятне подсветки повышает вероятность успешной юстировки. Затем отрегулируйте ручки фотодетектора на FM-головке, чтобы отцентрировать фотоприемник. Поместите свежерасщепленный лист слюды, прикрепленный к металлическому диску для образцов FM, на намагниченный держатель образца на верхней части пластины держателя FM.

Поверните держательную пластину FM так, чтобы диск для образца был установлен для первоначальной визуализации. Используйте управление поверхностью фокусировки программного обеспечения прибора, чтобы переместить FM-головку вниз к поверхности диска со слюдой. Пока в фокусе не появятся отличительные особенности на поверхности MICA или отражение кончика, выберите значок настройки в программном обеспечении инструмента и настройте консоль.

Резонансная частота рекомендуемых зондов MSNL или SNL составляет от 20 до 60 килогерц. Выберите смещение пика 5% для отображения образца MICA. Сначала установите датчик на поверхность MICA, установите начальный размер сканирования 10 микрометров и частоту сканирования на один герц.

Получение полных изображений сканирования поля 10 микрометров. Затем уменьшите размер сканирования до пяти, одного и 0,5 микрометра и сделайте полные снимки каждого поля. Отсоедините щуп, щелкнув один раз по значку отключения в программном обеспечении прибора.

Чтобы получить изображение интересующих биомолекул, смешайте пять микролитров подготовленного образца с 45 микролитрами свежего абсорбционного буфера. Осторожно добавьте 50 микролитров раствора, содержащего биомолекулу 0,5 микрограмма на миллилитр, непосредственно на поверхность МИКУ. Сделайте паузу на пять минут, чтобы биомолекулы в образце прилипли к поверхности слюды.

Затем пипеткой внесите еще от 50 до 100 микролитров абсорбционного буфера в держатель зонда для жидких клеток. Стараясь не прикасаться наконечником пипетки к зонду, FM-головке или MICA, отрегулируйте фотодетектор и при необходимости отрегулируйте лазер по отношению к кантилеверу. Затем используйте программное обеспечение прибора для повторного включения датчика.

Увеличьте размер сканирования, чтобы определить области интереса. После завершения визуализации несколько раз нажмите значок извлечения в программном обеспечении прибора, чтобы отсоединить пробник. Наконец, с помощью дистиллированной воды тщательно промойте держатель зонда жидкой клетки и диск для образцов.

Затем попробуйте сделать это со сжатым воздухом. Пример изображения в формате A FM показан здесь. Слюдяной субстрат обеспечивает молекулярно плоскую поверхность, на которую могут абсорбироваться ДНК и белки.

Визуализация MICA перед взятием проб биомолекул обеспечивает отрицательный контроль и оценку шума визуализации. Это также обеспечивает уровень уверенности в том, что кантилевер правильно настроен и последующая визуализация образца будет успешной. Двухцепочечная плазменная ДНК, предположительно суперзакрученная, легко идентифицируется по ее асимметричному внешнему виду и равномерному осаждению на ранее ничем не примечательный субстрат из слюды.

Белковые комплексы дискретных размеров частиц также однозначно отличаются от субстрата Micah. Различия в размерах частиц указывают на неоднородность образца и могут быть полезны для аппроксимации белка, сложной стоической геометрии или биохимической активности. Общая диагональная форма и последовательная ориентация белковых частиц наблюдаются.

Вот артефакт визуализации, поскольку белки ожидаемо были бы ориентированы на субстрат Micah случайным образом. Возможные причины наблюдаемого артефакта или физической аномалии зонда или ЧМ-визуализации с двумя скоростями сканирования, в то время как свертка зонда препятствует расчету абсолютной длины при измерении высоты по осям X и Y или по оси Z и относительных измерениях X и Y, тем не менее, могут быть полезны для оценки биофизических свойств визуализируемых биомолекул. Выполняя эту процедуру, важно помнить о точной настройке кантилевера и юстировке фотодетектора.

Другие шаги, в том числе использование буферообменной жидкости, могут быть добавлены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как способность молекулярных шаперонов влиять на высвобождение стероидных рецепторов из их ответных элементов ДНК. После просмотра этого видео вы должны лучше понять, как визуализировать белки ДНК и биомолекулярные комплексы с помощью атомно-силовой микроскопии в буферных условиях.