Субнанометровым Resolution Imaging с амплитудной модуляцией атомно-силовой микроскопии в жидком

Общая цель данной процедуры — достижение максимально возможного разрешения при получении изображений в жидкости с помощью коммерческого АСМ, работающего в режиме амплитудной модуляции, также известного как полуконтактный режим (tapping mode). Этот метод позволяет расширить границы стандартной работы АСМ в жидкой среде за счет использования оптимальной комбинации параметров для высокого разрешения. Основным преимуществом данной техники является то, что ее можно применять с большинством коммерческих АСМ, и, следовательно, она не требует никакого специализированного оборудования.

Представленный здесь метод предназначен для ученых и технических специалистов, которые уже обладают базовыми знаниями об АСМ, но хотели бы более эффективно использовать данный метод. Этот метод не ограничен каким-либо конкретным типом образца и может широко применяться к образцам из области физики, биологии, химии, материаловедения и прикладных наук. Как правило, новичкам в этой технике может быть трудно, поскольку поиск оптимальных параметров для конкретного образца требует определенного терпения.

Промойте в ультразвуковой ванне инструменты и диск-держатель подложки в ультрачистой воде. Затем повторите процедуру с изопропанолом и снова с ультрачистой водой, выдерживая каждый этап по 10 минут. При стремлении к высокому разрешению любое загрязнение может привести к пагубным последствиям.

Постоянно работайте в перчатках и убедитесь, что все поверхности или инструменты, которые контактируют с образцом, кантилевером или ячейкой АСМ, тщательно очищены. После ультразвуковой обработки просушите каждый из инструментов и диск с образцом потоком азота. Для получения изображений одиночных адсорбированных ионов металлов используйте стальной диск в качестве подложки для слюды.

Физически очистите поверхности, которые невозможно очистить с помощью соникации, протирая их однослойными безворсовыми салфетками, последовательно смоченными в ультрачистой воде, изопропаноле и снова в ультрачистой воде. Дайте поверхности высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Затем приготовьте небольшое количество эпоксидного клея, тщательно перемешав реагенты, и нанесите около 10 µL эпоксидного клея на очищенный стальной диск образца.

Поместите слюдяную подложку на эпоксидную смолу и зафиксируйте ее на стальном диске, надавив на подложку. Дайте эпоксидной смоле отвердиться в течение нескольких часов при повышенной температуре в соответствии со спецификациями производителя. Затем плотно прижмите к подложке кусок клейкой ленты шириной 2,5 сантиметра так, чтобы была закрыта вся поверхность, и плавно снимите верхний слой.

Повторяйте этот процесс два-три раза, пока поверхность слюды не станет зеркально гладкой на вид. Погрузите чип с кантилевером сначала в ванночку с изопропанолом, а затем в ультрачистую воду, выдерживая в каждой жидкости по 60 минут. После этого подвергните зонд воздействию УФ-излучения в течение пяти минут, чтобы способствовать формированию стабильных центров гидратации.

Слишком длительная экспозиция может повредить зонд или увеличить радиус его кривизны. Вставьте кантилевер в держатель кантилевера АСМ и с помощью пипетки нанесите 25 µL визуализирующей жидкости на кантилевер и зонд для предварительного увлажнения поверхности. Это позволит уменьшить появление пузырьков воздуха при приближении к образцу.

Приплавьте диск с образцом и подложку к столику для образцов и добавьте каплю визуализирующей жидкости на образец. Затем прикрепите держатель кантилевера к АСМ. Приблизьте кантилевер к образцу так, чтобы между жидкостями на кончике кантилевера и на образце образовался капиллярный мостик.

Используйте программное обеспечение АСМ для совмещения измерительного лазера с концом кантилевера в области зонда. Затем определите резонансную частоту кантилевера по основному пику его теплового спектра. Если отклонение кантилевера откалибровано, аппроксимация резонансного пика моделью гармонического осциллятора позволяет вычислить константу жесткости кантилевера.

Затем настройте кантилевер, определив его амплитудную характеристику при внешнем возбуждении в диапазоне частот, близких к резонансной частоте, выявленной в тепловом спектре. Отрегулируйте амплитуду возбуждения таким образом, чтобы амплитуда свободных колебаний составляла примерно пять нанометров. В большинстве АСМ этому обычно соответствует значение 0,2–0,8 В.

Затем установите заданную амплитуду примерно на 80% от амплитуды свободного колебания. Далее установите коэффициенты усиления обратной связи на относительно высокий уровень. Убедившись в отсутствии нестабильности или звона, установите начальную скорость сканирования примерно на 1 Гц, а размер области сканирования — на 10 нм.

Используя программное обеспечение для управления АСМ, инициируйте приближение зонда к поверхности. Определите, достиг ли зонд поверхности, не переходя к сканированию, путем небольшого изменения значения заданного значения (set point). Если зонд находится на поверхности, влияние на расширение зоны ZPA должно быть незначительным.

Как только зонд достигнет поверхности, выведите ZPA из рабочей зоны и заново настройте кантилевер. Резонансная частота, скорее всего, сместилась в сторону более низких значений из-за взаимодействия зонда с образцом. Теперь установите уставку (set point) примерно на 80% от вновь настроенной свободной амплитуды и активируйте кантилевер для проведения сканирования поверхности в режиме модуляции амплитуды с размером области 10 на 10 нанометров, чтобы убедиться в правильности параметров визуализации.

Убедитесь, что профили прямого и обратного сканирования совпадают. Если этого не произошло, дополнительно снизьте уставку и попробуйте увеличить коэффициенты усиления. Если изображение станет зашумленным, уменьшите коэффициенты усиления.

Повторите операцию для большой области образца размером от одного до пяти микрометров в квадрате, если это возможно. При работе с мягкими или биологическими образцами это может привести к загрязнению зонда. Уменьшите размер сканирования до значения, подходящего для визуализации интересующих особенностей.

Этот размер может составлять всего 20 на 20 нанометров. Затем достаточно уменьшить амплитуду возбуждения кантилевера, чтобы контур обратной связи автоматически отвел зону ZPA, тем самым подняв зонд над поверхностью. Пока кантилевер находится вне контакта с поверхностью, отрегулируйте амплитуду возбуждения так, чтобы амплитуда колебаний кантилевера составляла от одного до двух нанометров от пика до пика.

Постепенно снижайте уставку небольшими шагами до тех пор, пока зона ZPA снова не расширится в сторону поверхности и не будет восстановлено исходное изображение. Поддерживайте амплитуду уставки в диапазоне от 75% до 95% новой свободной амплитуды. Затем заново отрегулируйте коэффициент усиления, так как при более низких амплитудах можно использовать более высокие значения усиления без внесения значительного шума.

Оптимизируйте систему, чтобы найти наилучшее сочетание свободной амплитуды, уставки и коэффициента усиления для достижения высокого разрешения. Оптимальные условия системы зависят от образца, смачивающих свойств жидкости, а также от используемого кантилевера. Для сольфофильных интерфейсов используйте кантилеверы с константой жесткости от 0,5 до двух newtons per meter.

С помощью данного метода были получены изображения с субнанометровым разрешением для широкого спектра образцов. Представленные здесь мягкие образцы включают липидный бислой, пурпурные мембраны halobacterium salinarum, самособирающийся монослой амфифильных димолекул и кристаллы аквапорина из мембраны хрусталика быка. В каждом случае интересующие особенности выделены.

Малые амплитуды колебаний и высокие значения уставки сводят к минимуму силу воздействия зонда на образец, что позволяет получать изображения хрупких самосборок липидов в бислое, белков в нативных биомембранах и амфифильных молекул в растворе без их повреждения. С помощью этого подхода можно визуализировать и более твердые кристаллические материалы, такие как кальцит, титан стронция, карбид кремния, а также одиночные ионы металлов, адсорбированные на поверхности слюды, поскольку в каждом из этих случаев фактически визуализируется приграничный слой жидкости, а не сам кристалл. При правильном применении эта методика практически всегда обеспечивает разрешение на молекулярном или атомном уровне в жидкой среде.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что визуализируется межфазная жидкость. Это подразумевает использование мягких условий сканирования. Загрязнение зонда, образца или жидкости обычно является основной причиной невозможности достижения высокого разрешения.

При возникновении сомнений часто рекомендуется очистить все поверхности, контактирующие с жидкостью, и повторно использовать растворы для визуализации. Внешние шумы также негативно влияют на разрешение. Лучше использовать пол с низким уровнем вибрации, расположенный вдали от вентиляционного короба.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оптимизировать параметры визуализации для достижения высокого разрешения при использовании АСМ. Разумеется, как и в случае с любым передовым методом, может потребоваться несколько попыток, чтобы определить оптимальный способ визуализации образца, поэтому залогом успеха является терпение.