Субнанометровым Resolution Imaging с амплитудной модуляцией атомно-силовой микроскопии в жидком

Общая цель этой процедуры заключается в достижении максимально возможного разрешения изображения в жидкости с помощью коммерческого АСМ и амплитудной модуляции, также известной как режим постукивания. Этот метод позволяет раздвинуть границы стандартной работы АСМ в жидкости, используя наилучшее сочетание параметров для высокого разрешения. Основное преимущество этой техники заключается в том, что ее можно использовать с большинством коммерческих АСМ, и поэтому она не требует специального оборудования.

Представленный здесь метод предназначен для ученых и техников, которые уже обладают некоторыми базовыми знаниями об АСМ, но хотели бы получить больше от этой техники. Этот метод не нацелен на какой-либо конкретный тип образцов и может быть широко применен к образцам из физики, биологии, химии, материаловедения и сервисных наук. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, будут испытывать трудности, потому что она требует некоторого терпения, чтобы найти лучшие параметры для данного образца.

Ванна с ультразвуком обрабатывают приборы, а диск поддерживает подложку в ультрачистой воде. Затем изопропанол и снова ультрачистая вода, каждый по 10 минут. При стремлении к высокому разрешению любое загрязнение может иметь пагубные последствия.

Всегда надевайте перчатки и убедитесь, что все поверхности или инструменты, контактирующие с образцом, консолью или ячейкой АСМ, тщательно очищены. После ультразвуковой обработки высушите каждый из инструментов и диск с образцом под потоком азота. Используйте стальной диск в качестве подложки для слюды, чтобы получить изображение одиночных поглощенных ионов металлов.

Физически очистите поверхности, которые не могут быть очищены ультразвуком, протирая их однослойными салфетками с низким ворсом, смоченными в ультрачистой воде, изопропаноле и ультрачистой воде последовательно. Дайте поверхности высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Затем приготовьте небольшое количество эпоксидного клея, тщательно перемешав реагенты, и поместите около 10 микролитров эпоксидной смолы на диск с чистым стальным образцом.

Поместите слюдяную подложку на эпоксидную смолу и прикрепите ее к стальному диску, надавливая на подложку. Дайте эпоксидной смоле затвердеть в течение нескольких часов при повышенной температуре в соответствии со спецификациями производителя. Затем плотно прижмите к подложке кусок скотча шириной 2,5 сантиметра, чтобы покрыто все лицо, и плавно снимите верхний слой.

Повторите этот процесс два-три раза, пока слюда не станет зеркально гладкой для глаза. Погрузите консольную стружку в ванну с изапропанолом, а затем в ультрачистую воду на 60 минут. Затем подвергните наконечник воздействию ультрафиолетового света на срок до пяти минут, чтобы способствовать образованию стабильных участков увлажнения.

Более длительное время передержки может повредить наконечник или увеличить радиус его кривизны. Вставьте консоль в держатель консоли AFM и нанесите 25 микролитров жидкости для визуализации на консоль и наконечник, чтобы предварительно смочить поверхность. Это уменьшит появление пузырьков воздуха при приближении к образцу.

Расплавьте диск и подложку образца на предметном столике и добавьте каплю жидкости для визуализации в образец. Затем подключите держатель консоли к АСМ. Поднесите кантилевер и образец в непосредственной близости так, чтобы образовался капиллярный мостик между жидкостями на наконечнике кантилевера и жидкостями на образце.

Используйте программное обеспечение AFM, чтобы выровнять измерительный лазер близко к наконечнику консоли. Затем найдите частоту пребывания кантилевера от главного пика в его тепловом спектре. Если отклонение кантилевера откалибровано, то подгонка пика резидента с помощью простой модели гармонического осциллятора дает постоянную пружины консоли.

Затем настройте кантилевер, найдя его амплитудную характеристику при внешнем воздействии в диапазоне частот, близких к резонансной частоте, определенной в тепловом спектре. Отрегулируйте амплитуду управления так, чтобы амплитуда свободных колебаний составляла примерно пять нанометров. Обычно это соответствует 0,2-0,8 вольт на большинстве АСМ.

Затем отрегулируйте заданное значение амплитуды примерно на 80% от свободной амплитуды. Затем установите относительно высокий прирост обратной связи. Убедившись в отсутствии нестабильности или звона, установите начальную частоту сканирования примерно в один герц, а размер сканирования — на 10 нанометров.

Инициируйте приближение наконечника к поверхности с помощью управляющего программного обеспечения АСМ. Оцените, достиг ли зонд поверхности без начала изображения, слегка изменив значение заданной точки. Если наконечник находится на поверхности, влияние на расширение зоны ZPA должно быть незначительным.

Как только наконечник достигнет поверхности, втяните зону ZPA и перенастройте консоль. Резонансная частота, вероятно, сместится на более низкое значение из-за взаимодействия образца зонда. Теперь измените установочное значение примерно на 80% от только что настроенной свободной амплитуды и включите кантилевер для проведения сканирования поверхности размером 10 на 10 нанометров в квадрате в режиме амплитудной модуляции, чтобы убедиться в том, что параметры изображения являются подходящими.

Убедитесь, что профили трассировки и повторной трассировки накладываются друг на друга. Если нет, еще больше уменьшите заданное значение и попробуйте увеличить усиление. Если изображение становится зашумленным, уменьшите усиление.

Повторите операцию с большой областью образца размером от одного до пяти микрометров в квадрате, если это возможно. На мягких или биологических образцах это может привести к загрязнению наконечника. Уменьшите размер сканирования до значения, подходящего для визуализации интересующих объектов.

Это может быть всего лишь 20 на 20 нанометров. Далее уменьшите амплитуду привода кантилевера настолько, чтобы петля обратной связи автоматически втянула зону ZPA, усилив наконечник от поверхности. Когда кантилевер находится вдали от поверхности, отрегулируйте амплитуду привода так, чтобы амплитуда кантилевера составляла от одного до двух нанометров от пика до пика.

Постепенно уменьшайте заданное значение небольшими шагами, пока зона ZPA снова не расширится к поверхности, и исходное изображение не будет восстановлено. Поддерживайте заданную амплитуду в диапазоне от 75% до 95% от новой свободной амплитуды. Затем отрегулируйте усиление, так как более высокие коэффициенты усиления можно использовать при более низких амплитудах без внесения значительного шума.

Оптимизируйте систему, чтобы найти наилучшее сочетание свободной амплитуды, заданного значения и коэффициента усиления для получения высокого разрешения. Оптимальные условия системы зависят от образца, смачивающих свойств жидкости, а также используемого кантилевера. Для сольвофильных интерфейсов используйте консоли с пружинной постоянной от 0,5 до двух ньютонов на метр.

С помощью этой методики были получены изображения с субнанометровым разрешением для широкого диапазона образцов. Показанные здесь мягкие образцы включают липидный бислой, фиолетовые мембраны из halobacterium salinarum, самоорганизующийся монослой амфофильных димолекул и кристаллы аквапорина из мембраны бычьего хрусталика. В каждом конкретном случае выделяются интересующие особенности.

Малые амплитуды колебаний и высокие заданные значения минимизируют силу, оказываемую зондом на образец, что позволяет визуализировать хрупкие самосборки липидов в бислое, белков в нативных биомембранах и амфофильных молекул в растворе без повреждений. Более твердые кристаллические материалы, такие как кальцит, титанит стронция, карбид кремния и ионы одиночных металлов, поглощенные на поверхности слюды, могут быть визуализированы с помощью этого подхода, потому что в каждом случае эффективно визуализируется межфазная жидкость, а не сам кристалл. После освоения этот метод обеспечивает разрешение на молекулярном или атомном уровне в жидкости почти каждый раз, когда он выполняется правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что визуализируется межфазная жидкость. Это означает использование мягких условий визуализации. Загрязнение наконечника, образца или жидкости обычно является основной причиной невозможности достичь высокого разрешения.

Если у вас есть какие-либо сомнения, часто бывает хорошей идеей очистить все поверхности, контактирующие с жидкостью, и повторно использовать растворы для визуализации. Внешний шум также пагубно влияет на высокое разрешение. Лучше пол с низким уровнем вибрации, вдали от вентиляционного канала.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оптимизировать параметры изображения для достижения АСМ высокого разрешения. Конечно, как и в случае с любой передовой техникой, может потребоваться несколько попыток, чтобы понять, как лучше всего получить изображение образца, поэтому терпение является ключевым фактором.