Микро-механические характеристики легочной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы охарактеризовать локальную механическую среду паренхимы легких в пространственном масштабе, относящемся к резидентным клеткам, путем непосредственного измерения локальных упругих свойств свежей зеркальной легочной ткани с помощью микроиндентирования методом атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем разрезания надутой мышиной легочной ткани агарро бритвой или лезвием скальпеля для получения полосок легочной паренхимы размером пять на пять миллиметров в длину и ширину и толщиной 400 микрометров. Следующими нефиксированными полосками легочной ткани являются иммуноокрашивание, которое определяет области, представляющие интерес для микроиндентирования FM.

Затем выполняется FM микроиндентирование на тканевых полосках в PBS при комнатной температуре. Для непосредственного измерения местных эластических свойств свежей легочной ткани получаются результаты. Это показывает поразительные различия в диапазоне и распределении жесткости тканей в нормальной и фиброзной паренхиме легких, а также большие пространственные вариации жесткости, особенно в образце фиброзного легкого.

На основе карт жесткости, извлеченных из кривых принудительного перемещения, полученных с помощью микроиндентирования FM. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими мерами, такими как растяжение тканевой полоски, заключается в том, что он обеспечивает беспрецедентное пространственное разрешение, обеспечивая уникальный взгляд на микромасштабные изменения жесткости тканей. Эта мера может помочь ответить на ключевые вопросы, такие как пространственное изменение жесткости в ткани и каков масштаб и пространственный масштаб изменений жесткости при заболевании.

Процессы, приводящие к ремоделированию тканей: Приготовление полосок легочной ткани начинается со стабилизации структуры легких для разреза путем надувания изолированных легких мыши. Внутритрахеально с концентрацией 50 миллилитров на килограмм массы тела теплого, 2%-ного гелеобразного тепла, приготовленного в PBS, перевязывают трахею и охлаждают надутые легкие в ванне PBS при четырех градусах Цельсия в течение 60 минут. В течение этого интервала с помощью бритвы или скальпеля разрежьте стабилизированную мышиную легочную ткань на полоски примерно пять на пять миллиметров в длину и ширину и 400 микрометров в толщину.

Затем промойте полоски в PBS при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы удалить остатки и исключить крупные дыхательные пути и сосуды. Отрежьте полоски из субплевральных областей, удаленных от основных стволовых бронхов, если необходимо визуализировать дыхательные пути и крупные сосуды, отрежьте полоски из легочной ткани, расположенной ближе к основным стволовым бронхам, чтобы изолировать области, представляющие интерес для микроиндентирования FM. Визуализируйте ткань с помощью контрастной микроскопии лица или иммуноокрашивания и визуализируйте с помощью флуоресцентной микроскопии.

Пожалуйста, ознакомьтесь с письменной частью этого протокола для ознакомления с процедурой. Непосредственно перед определением характеристик FM прикрепите тканевые полоски к 15-миллиметровым покровным стеклам, покрытым поли-L лизином, подняв покровное стекло из-под плавающей ткани, убедившись, что тканевая полоска равномерно распределяется по поверхности покровного стекла. При необходимости наденьте на полоску второй чистый покровный лист без покрытия и слегка надавите, чтобы облегчить прикрепление ткани к покровному накладочному покрытию с покрытием из поли-L-лизина.

Калибруйте систему A FM в соответствии с инструкциями производителя непосредственно перед каждым раундом экспериментов по микроиндентированию. Для этого определите два критических параметра. Постоянная консольной пружины с использованием метода тепловых колебаний в воздухе и чувствительность кантилевера к отклонению, которая является параметром, используемым для масштабирования выходного сигнала фотодиода до фактического расстояния отклонения кантилевера.

Откалибруйте чувствительность к прогибу путем получения стандартной кривой принудительного смещения в PBS на чистом предметном стекле. Затем рассчитайте наклон кривой принудительного смещения при измерении кривой принудительного перемещения. Зонд A FM выдвигается к поверхности образца и отводится от нее в одном месте, при этом отклонение кантилевера delta D контролируется как функция смещения наконечника delta Z.It рекомендуется использовать треугольный кантилевер из нитрида кремния с босиликатным сферическим наконечником диаметром пять микрометров с помощью FM-зондов с постоянной пружины 0,06 ньютона на метр.

Мы располагаем механически охарактеризованными мягкими материалами с прозрачной модуляцией от 100 до 50 000 паскалей. Протрите нижнюю поверхность крышки образца салфеткой папиросной бумагой, затем закрепите ее на стандартном предметном стекле с помощью вакуумной смазки. Установите предметное стекло на предметный столик для образца A FM и накройте ткань 500 микролитрами PBS комнатной температуры.

Затем поместите на образец сканирующую головку FM. Отрегулируйте предметный столик микроскопа, чтобы настроить микроскоп для просмотра окуляра, чтобы выровнять наконечник A FM по центру поля зрения. Переместите предметный столик для образца A FM, чтобы выбрать интересующую область на ткани.

Затем переключитесь на просмотр с ПЗС-камеры для записи фазово-контрастного изображения и/или флуоресцентных изображений ткани по желанию. Медленно перемещайте наконечник A FM вниз, пока он не войдет в точный контакт с образцом. Для определения характеристик мягких образцов с помощью микроиндентирования FM требуется малая глубина вдавливания, чтобы избежать больших локальных деформаций, что делает недействительной модель Герца, используемая для расчета модуля упругости, чтобы избежать больших деформаций, выполнить вдавливание в триггерном режиме, установив максимальное отклонение кантилевера на 500 нанометров.

Этот предел прогиба ограничивает максимальную силу вдавливания менее чем 30 наноньютонами. Скорость вдавливания должна быть выбрана достаточно медленной, чтобы исследовать упругие, а не вязкоупругие свойства мягкого образца. Выберите диапазон скоростей от двух до 20 микрометров в секунду для легочной ткани для одного измерения из интересующей области.

Переместите датчик A FM в интересующее место и выполните одно отступление, чтобы собрать стандартную кривую смещения силы. Зонд будет двигаться только в направлении Z. Для автоматического картографирования интересующей области переключитесь в режим принудительного картографирования, выберите размер сканирования и точки выборки в пределах выбранной области.

Наконечник A FM перемещается по поверхности образца между движениями вдавливания и собирает отдельные кривые принудительного смещения в каждой точке в пределах сетки образцов, определенной в независимом масштабе. Мы сочли целесообразным использовать сетку образцов 16 на 16 для картографирования области размером 80 на 80 микрометров со скоростью вдавливания 20 микрометров в секунду, что может быть выполнено примерно за 10 минут. Чтобы рассчитать аппроксимацию модуля Юнга, кривую смещения силы соответствуйте модели сферического отступа Герца с использованием нелинейной аппроксимации кривой квадрата Ли, как показано здесь, где F равно K sub C, умноженная на дельту, D — сила изгиба консоли.

K sub C — постоянная консольной пружины. R — радиус кончика сферы дельта равна дельте Z минус дельта D — вдавливание, а новым является коэффициент Пуассона образцов, который для легочной ткани равен 0,4. Чтобы оценить качество аппроксимации, вычислите значение SSR или сумму квадратов разницы между данными и значениями аппроксимации во время подгонки нелинейной кривой.

Исключите ненадежные или неинтерпретируемые измерения, отбросив данные с плохих кривых с большими значениями SSR. При желании преобразуйте модуль упругости или E в модуль прозрачности. G. Используя соотношение E, равное двукратной сумме единицы плюс новые времена, G.To визуализировать пространственные закономерности жесткости, собранные в режиме карты сил, построения данных модуля упругости и контурных карт, например, в сетке 16 на 16, охватывающей площадь 80 на 80 микрометров.

Для обработки большого количества данных силовой кривой может быть написан пользовательский алгоритм для автоматической подгонки кривых смещения силы, извлечения модульных и/или построения контурных карт или прививки ELA. Используя те же процедуры и параметры, которые только что описаны, этот рисунок показывает, что я правильно режу и окрашиваю ткани. Альвеолярная микрофибра легочной паренхимы хорошо сохраняется, что наблюдается при иммунофлуоресцентном окрашивании компонента базальной мембраны, ламинина без фиксации или проникновения.

Эти панели показывают иммунофлуоресцентное окрашивание коллагена, одно в свежих нефиксированных легких, собранных у мышей, ранее получавших PBS или обработанных блио-мицином для индуцирования фиброза. Здесь показаны графики смещения силы выборки, полученные из микроиндентирования FM, с той же приложенной силой. Наконечник A FM создает большое углубление на мягкой области, что приводит к относительно плоской кривой смещения, показанной синим цветом, по сравнению с небольшим углублением и крутой кривой смещения силы для более жесткой области, показанной красным цветом.

Чтобы получить четкие силовые кривые после каждого вдавливания, наконечник A FM должен быть полностью втянут от поверхности образца и бесконтактно с ним перед следующим вдавливанием. Это бесконтактное состояние соответствует плоской области кривой, где зонд перемещается без прогиба кантилевера. На этом рисунке показана типичная ложная кривая без плоской области, которая возникает, когда наконечник не полностью втягивается от поверхности образца, например, когда мягкий образец прикрепляется к наконечнику, что делает невозможным определение точки контакта, если наконечник полностью захвачен мягким образцом.

Кривая может выглядеть так без явного прогиба, но с небольшим шумом. На этом рисунке показана жесткость. Данные, полученные из кривых принудительного смещения, отображаются в пространственном пространстве в виде карт жесткости, называемых трансплантатом ELAs, где цветовые шкалы с жесткостью трансплантата ELA демонстрируют поразительные различия в диапазоне и распределении жесткости тканей при нормальной и фиброзной паренхиме легких и большие пространственные вариации жесткости, особенно в образце фиброзного легкого.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как охарактеризовать локальную механическую среду легочной паренхимы путем непосредственного измерения локальных упругих свойств свежей легочной ткани с помощью микроскопической копии Atomic Force.