Моделирование рака предстательной железы на генетически модифицированных моделях мышей: CRISPR/Cas9-опосредованная техника локализованного редактирования генов в клетках передней доли предстательной железы мыши

Начните с обезболенной и подготовленной модели мыши CRISPR/Cas9, несущей геном, спроектированный для экспрессии эндонуклеаз Cas9 и зеленых флуоресцентных белков, или GFP, сильным восходящим промотором. Кассета floxed-STOP или LSL, вставленные непосредственно после промотора, блокируют транскрипцию Cas9 и GFP в нормальных условиях.

Разрежьте брюшную стенку мыши, чтобы обнажить ее переднюю долю предстательной железы, прикрепленную к семенному пузырьку. Введите желаемую аденовирусную суспензию в переднюю долю, чтобы облегчить целевую доставку вирусного генома в клетки. Поместите долю простаты обратно в брюшную полость и зашите разрез.

В инфицированных вирусом клетках вирусный геном экспрессирует ферменты рекомбиназы Cre и направляющие РНК, нацеленные на ген, который должен быть мутирован. Ферменты Cre распознают кассету LSL и удаляют блокатор транскрипции флоксида. Этот шаг позволяет промотору управлять экспрессией эндонуклеаз Cas9 и GFP.

Впоследствии эндонуклеазы Cas9 образуют комплексы с кодируемыми вирусом направляющими РНК, которые направляют эти комплексы к целевой последовательности в мутируемом гене. Такая локализация позволяет эндонуклеазе Cas9 расщеплять геномную ДНК в пределах гена-мишени, что приводит к генетическим изменениям.

Онкогенное изменение приводит к тому, что мутировавшие клетки превращаются в раковые. Совместная экспрессия репортерных белков GFP в мутировавших клетках облегчает идентификацию и отслеживание прогрессирования рака.

Чтобы доставить вирус в простату, после обезболивания 8-недельного самца мыши в соответствии с текстовым протоколом исследуйте глубину анестезии, оценивая мышечную релаксацию, отвод педалей и глазные рефлексы. Когда наблюдается потеря рефлексов, следует побрить нижнюю часть живота животного. С помощью стерильного ватного тампона тщательно прикройте глаза животного ветеринарной офтальмологической мазью, чтобы предотвратить слепоту, вызванную ксерофтальмией. Затем используйте 70% этанол и 10% повидон-йод для протирания бритого живота, чтобы продезинфицировать операционную область.

Далее с помощью стерильных хирургических ножниц сделайте вертикальный разрез кожи примерно на 1 сантиметр в нижней части живота. Затем с помощью тонко острых щипцов приподнимите брюшину, чтобы не повредить органы, которые лежат под ней, и с помощью хирургических ножниц осторожно сделайте разрез 8 миллиметров или короче через брюшину. Аккуратно отодвиньте жировую ткань в сторону, чтобы обнажить семенной пузырь. Затем с помощью кольцевых щипцов осторожно приподнимают семенной пузырь вверх до тех пор, пока не будет выявлена передняя простата.

Теперь с помощью инсулинового шприца объемом 0,5 миллилитра и иглы размером 30 г x 8 миллиметров введите в общий объем 30 микролитров раствора вируса в эпителий передней предстательной железы. Сведите к минимуму утечку и убедитесь, что жидкость впитывается в ткани, образуя небольшой пузырь. Затем поместите семенной пузырь обратно в брюшную полость.

Чтобы убедиться, что жидкость всасывается в ткани в виде небольшого пузырька и без утечки, обязательно вводите жидкость параллельно семенному пузырьку и повторяя форму передней доли предстательной железы.

С помощью иглы с коническим концом и кругом 13 миллиметров, 3/8, сшите брюшину двумя-тремя простыми прерывистыми стежками рассасывающегося шва 6-0. Затем, подтянув кожу щипцами, чтобы не повредить брюшину, скрепите кожу тремя стерильными зажимами размером 4,8 х 6,5 миллиметров.

Для лучшего восстановления после операции используйте стерильный шприц объемом 1 миллилитр и иглу размером 27 г x 1/2 дюйма для введения антидота от анестезии в дозе 0,1 миллилитра на грамм массы тела путем внутрибрюшинной инъекции. Затем осторожно поместите животное обратно в клетку.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.