Моделирование рака предстательной железы на генетически модифицированных моделях мышей: CRISPR/Cas9-опосредованная техника локализованного редактирования генов в клетках передней доли предстательной железы мыши

Начните с обезболенной и подготовленной модели мыши CRISPR/Cas9, несущей геном, спроектированный для экспрессии эндонуклеаз Cas9 и зеленых флуоресцентных белков, или GFP, сильным восходящим промотором. Кассета floxed-STOP или LSL, вставленные непосредственно после промотора, блокируют транскрипцию Cas9 и GFP в нормальных условиях.

Разрежьте брюшную стенку мыши, чтобы обнажить ее переднюю долю предстательной железы, прикрепленную к семенному пузырьку. Введите желаемую аденовирусную суспензию в переднюю долю, чтобы облегчить целевую доставку вирусного генома в клетки. Поместите долю простаты обратно в брюшную полость и зашите разрез.

В инфицированных вирусом клетках вирусный геном экспрессирует ферменты рекомбиназы Cre и направляющие РНК, нацеленные на ген, который должен быть мутирован. Ферменты Cre распознают кассету LSL и удаляют блокатор транскрипции флоксида. Этот шаг позволяет промотору управлять экспрессией эндонуклеаз Cas9 и GFP.

Впоследствии эндонуклеазы Cas9 образуют комплексы с кодируемыми вирусом направляющими РНК, которые направляют эти комплексы к целевой последовательности в мутируемом гене. Такая локализация позволяет эндонуклеазе Cas9 расщеплять геномную ДНК в предел