Моделирование рака предстательной железы на генетически модифицированных моделях мышей: CRISPR/Cas9-опосредованная техника локализованного редактирования генов в клетках передней доли предстательной железы мыши

Начните с обезболенной и подготовленной модели мыши CRISPR/Cas9, несущей геном, спроектированный для экспрессии эндонуклеаз Cas9 и зеленых флуоресцентных белков, или GFP, сильным восходящим промотором. Кассета floxed-STOP или LSL, вставленные непосредственно после промотора, блокируют транскрипцию Cas9 и GFP в нормальных условиях.

Разрежьте брюшную стенку мыши, чтобы обнажить ее переднюю долю предстательной железы, прикрепленную к семенному пузырьку. Введите желаемую аденовирусную суспензию в переднюю долю, чтобы облегчить целевую доставку вирусного генома в клетки. Поместите долю простаты обратно в брюшную полость и зашите разрез.

В инфицированных вирусом клетках вирусный геном экспрессирует ферменты рекомбиназы Cre и направляющие РНК, нацеленные на ген, который должен быть мутирован. Ферменты Cre распознают кассету LSL и удаляют блокатор транскрипции флоксида. Этот шаг позволяет промотору управлять экспрессией эндонуклеаз Cas9 и GFP.

Впоследствии эндонуклеазы Cas9 образуют комплексы с кодируемыми вирусом направляющими РНК, которые направляют эти комплексы к целевой последовательности в мутируемом гене. Такая локализация позволяет эндонуклеазе Cas9 расщеплять геномную ДНК в пределах гена-мишени, что приводит к генетическим изменениям.

Онкогенное изменение приводит к тому, что мутировавшие клетки превращаются в раковые. Совместная экспрессия репортерных белков GFP в мутировавших клетках облегчает идентификацию и отслеживание прогрессирования рака.

Чтобы доставить вирус в простату, после обезболивания 8-недельного самца мыши в соответствии с текстовым протоколом исследуйте глубину анестезии, оценивая мышечную релаксацию, отвод педалей и глазные рефлексы. Когда наблюдается потеря рефлексов, следует побрить нижнюю часть живота животного. С помощью стерильного ватного тампона тщательно прикройте глаза животного ветеринарной офтальмологической мазью, чтобы предотвратить слепоту, вызванную ксерофтальмией. Затем используйте 70% этанол и 10% повидон-йод для протирания бритого живота, чтобы продезинфицировать операционную область.

Далее с помощью стерильных хирургических ножниц сделайте вертикальный разрез кожи примерно на 1 сантиметр в нижней части живота. Затем с помощью тонко острых щипцов приподнимите брюшину, чтобы не повредить органы, которые лежат под ней, и с помощью хирургических ножниц осторожно сделайте разрез 8 миллиметров или короче через брюшину. Аккуратно отодвиньте жировую ткань в сторону, чтобы обнажить семенной пузырь. Затем с помощью кольцевых щипцов осторожно приподнимают семенной пузырь вверх до тех пор, пока не будет выявлена передняя простата.

Теперь с помощью инсулинового шприца объемом 0,5 миллилитра и иглы размером 30 г x 8 миллиметров введите в общий объем 30 микролитров раствора вируса в эпителий передней предстательной железы. Сведите к минимуму утечку и убедитесь, что жидкость впитывается в ткани, образуя небольшой пузырь. Затем поместите семенной пузырь обратно в брюшную полость.

Чтобы убедиться, что жидкость всасывается в ткани в виде небольшого пузырька и без утечки, обязательно вводите жидкость параллельно семенному пузырьку и повторяя форму передней доли предстательной железы.

С помощью иглы с коническим концом и кругом 13 миллиметров, 3/8, сшите брюшину двумя-тремя простыми прерывистыми стежками рассасывающегося шва 6-0. Затем, подтянув кожу щипцами, чтобы не повредить брюшину, скрепите кожу тремя стерильными зажимами размером 4,8 х 6,5 миллиметров.

Для лучшего восстановления после операции используйте стерильный шприц объемом 1 миллилитр и иглу размером 27 г x 1/2 дюйма для введения антидота от анестезии в дозе 0,1 миллилитра на грамм массы тела путем внутрибрюшинной инъекции. Затем осторожно поместите животное обратно в клетку.