Протокол для множественного нокаута гена в мышиных органоидах малого кишечника Использование CRISPR-конкатэмера

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы клонировать несколько направляющих РНК в один вектор CRISPR-конкатемера и достичь высокоэффективной электропорации в кишечных органоидах мышей с целью одновременного нокаутирования нескольких генов. Этот метод может значительно повысить эффективность исследований потери функции, позволяя преодолеть потенциальный эффект параллельной компенсации. Основными преимуществами нашей стратегии CRISPR-конкатемеров являются удобство проведения одного этапа клонирования и возможность одновременного нокаута до четырех разных генов.

Демонстрацию процедуры будет проводить Алессандра Меренда, аспирантка из моей лаборатории. Клонирование направляющих РНК или гРНК в вектор CRISPR-конкатемер начинается с одной реакции на отжиг верхней и нижней цепей каждого олигонуклеотида гРНК и фосфорилирование их концов. Приготовьте реакционную смесь на льду, для трех конкатемеров используйте три микролитра гРНК верхней цепи, три микролитра гРНК нижней цепи, два микролитра буфера ДНК-лигазы Т4, один микролитр полинуклеотидкиназы Т4 и воду общим объемом до 20 микролитров.

Хорошо перемешайте с помощью пипетки и запуска термоамплификатора в следующих режимах: 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, уменьшите температуру до 25 градусов Цельсия со скоростью 0,3 градуса Цельсия в минуту и удерживайте при температуре четыре градуса Цельсия. Следующим этапом является реакция шаркануклеотидов Bbs1, в которой предварительно отожженные олигонуклеотиды гРНК встраиваются в соответствующее положение конкатемерового вектора. Разбавьте реакционную смесь от одного до 100 в ДНК, свободной от РНК воде, чтобы получить три и четыре вектора конкатемера гРНК.

Соберите Bbs1, перетасовывая реакции на льду. Используйте 100 нанограмм вектора CRISPR-конкатемер, 10 микролитров смеси олигонов, один микролитр буфера фермента рестрикции, один микролитр DTT, один микролитр АТФ, один микролитр фермента Bbs1, один микролитр Т7-лигазы и воду общим объемом до 20 микролитров. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования, включите отрицательный контроль, который содержит вектор.

Запустите реакции в термоамплификаторе, используя следующие настройки, для клонирования трех и четырех конкатемеров гРНК, запустите 50 циклов при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут и 21 градусе Цельсия в течение пяти минут, удерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем удерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение неопределенного времени. Для двух конкатемеров гРНК выполните те же настройки с 25 циклами первого шага. Когда реакция перемешивания Bbs1 завершена, возьмите по 11 микролитров каждой смеси для лигирования и добавьте 1,5 микролитра буфера экзонуклеазы, 1,5 микролитра АТФ, один микролитр ДНК-экзонуклеазы и воду до общего объема 15 микролитров.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, а затем при температуре 70 градусов Цельсия в течение 30 минут. Впоследствии реакционная смесь используется для преобразования химически компетентных бактерий E.Coli в соответствии со стандартным протоколом. Чтобы подтвердить наличие вставок гРНК в векторе CRISPR-конкатемер, выберите колонии бактерий с инокуляционной петлей и инокулируйте каждую в четыре миллилитра среды LB.

Выращивайте клонов за ночь при температуре 37 градусов по Цельсию в орбитальном шейкере. На следующий день ДНК извлекается с помощью набора для мини-подготовки плазмиды, в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте примерно 200 нанограммов каждого образца ДНК с 10 единицами EcoR1 и пятью единицами BglII в реакции объемом 10 микролитров.

Включите отдельную реакционную смесь с соответствующим исходным вектором в качестве положительного контроля для сравнения размеров. Инкубируйте реакции при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Запустите реакции пищеварения на 1%-ном агарозном геле при напряжении 90 вольт в течение примерно 20 минут.

Визуализируйте гель с помощью УФ-трансиллюминатора, чтобы определить клоны с правильным размером вставки. Чтобы подтвердить, что гРНК были клонированы в нужное положение и, следовательно, все сайты узнавания Bbs1 были утрачены, расщепите выбранные клоны с пятью единицами Bbs1. Включите отдельную реакционную смесь с соответствующим исходным вектором в качестве контроля.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов, запускайте реакции пищеварения на 1%-ном агарозном геле при напряжении 90 вольт в течение примерно 20 минут. Визуализируйте гель с помощью УФ-трансиллюминатора, чтобы определить векторы, которые не разрезаются Bbs1. При расщеплении органоидов для электропорации засейте не менее шести лунок 48-луночного планшета за одну трансвекцию.

Засейте органоиды в капли матрицы объемом 20 микролитров и вырастите их в 250 микролитрах WENR плюс никотинамидная среда на лунку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненном инкубаторе. На второй день замените среду WENR плюс никотинамид на 250 микролитров EGF плюс ноггин, ингибитор GSK3 и ингибитор горных пород без антибиотиков. На третий день замените органоидную среду на EGF плюс ноггин, ингибитор GSK3, ингибитор породы и 1,25% диметилсульфоксид без антибиотиков.

На четвертый день разрушьте купола матрицы основания с помощью наконечника для пипетки объемом один миллилитр и перенесите органоиды в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Вытяните содержимое четырех лунок 48-луночной пластины в одну пробирку. Механически разбейте органоиды на мелкие фрагменты, пипетируя пипеткой P200 вверх и вниз примерно 200 раз.

Центрифугируйте при 600-кратном перегрузке в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования удалите среду из всех пробирок и повторно суспендируйте поддоны в одном миллилитре рекомбинантной протеазы клеточной культуры. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия не более пяти минут.

Важно тщательно следить за лечением протеазы, потому что успех электропорации зависит от получения клеточной суспензии, содержащей кластеры клеток, а не отдельные клетки. Проверьте каплю образца объемом 50 микролитров под микроскопом с инвертированным светом с четырехкратным объективом. Желательны кластеры от 10 до 15 клеток, так как это увеличивает выживаемость клеток после электропорации.

Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров с низким связыванием и устраните диссоциацию, добавив девять миллилитров базальной среды без антибиотиков. Центрифугируйте его при 600-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте палитру в одном миллилитре восстановленной сыворотки среды.

Подсчитайте количество клеток с камерой Беркса, минимум один умножить на 10 до пятой клетки требуется на одну реакцию электропорации. Начните эту процедуру с добавления девяти миллилитров восстановленной сывороточной среды в 15-миллилитровую пробирку, содержащую клеточную суспензию, и центрифугируйте при 400-кратном перегрузке в течение трех минут при комнатной температуре. Удалите всю надосадочную жидкость и снова суспензируйте палитру в растворе для электропорации.

Добавьте в общей сложности 10 микрограммов ДНК в две новые пробирки. Затем добавьте раствор для электропорации до конечного объема 100 микролитров и держите смесь ДНК клетки на льду. Перенесите смесь ДНК клетки в кювету для электропорации, поместите кювету в камеру электропоратора.

Измерьте импеданс, нажав соответствующую кнопку на электропораторе, и убедитесь, что он составляет от 0,030 до 0,055 Ом. Проводите электропорацию в соответствии с настройками, указанными в текстовом протоколе. Добавьте в кювету 400 микролитров буфера для электропорации плюс ингибитор горных пород, а затем переложите все его содержимое в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы дать клеткам восстановиться. Через 30 минут вращайте при 400-кратном G в течение трех минут при комнатной температуре. Снимите надосадочную жидкость и снова суспендируйте палитру по 20 микролитров на лунку цокольной матрицы.

Засейте примерно один раз от 10 до 10 до 10 до пяти клеток на лунку в 48-луночной пластине и добавьте EGF плюс ноггин, ингибитор GSK3, ингибитор породы и 1,25% диметилсульфоксид среды. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день измените среду на EGF плюс ноггин, ингибитор GSK3 и ингибитор горных пород и проверьте эффективность трансвекции, наблюдая за экспрессией GFP.

Держите органоиды при температуре 37 градусов по Цельсию. Через два дня замените среду свежей средой. Через четыре дня после электропорации смените среду на WENR плюс никотинамид и ингибитор горных пород и продолжайте инкубацию клеток при температуре 37 градусов Цельсия.

Наличие правильного количества вставок гРНК в конкатемерном векторе подтверждается двойным рестрикционным расщеплением с EcoR1 и BglII. Ожидаемый размер нижней полосы составляет приблизительно 1,6 килооснования для вектора с четырьмя гРНК и 1,2 килооснования для вектора с тремя конкатемерами из трех гРНК. Кроме того, расщепление с помощью Bbs1 подтверждает, что гРНК были клонированы в нужное положение и, следовательно, все сайты узнавания Bbs1 теряются.

Подтвержденные конструкции доставляются в кишечные органоиды мышей путем электропорации для достижения эффективности трансвекции до 70%, как показывает экспрессия GFP. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как генерировать векторы конкатемеров гРНК и как эффективно доставлять их в 3D-органоидные культуры с помощью электропорации, чтобы добиться нокаута нескольких генов одновременно.