Протокол для множественного нокаута гена в мышиных органоидах малого кишечника Использование CRISPR-конкатэмера

Общая цель данного протокола заключается в клонировании нескольких гидовых РНК в один вектор CRISPR-конкатемера и достижении высокоэффективной электропорации кишечных органоидов мыши для одновременного нокаута нескольких генов. Этот метод может значительно повысить эффективность исследований потери функции, позволяя преодолеть потенциальный эффект параллельной компенсации. Основными преимуществами нашей стратегии с использованием CRISPR-конкатемера являются удобство одного этапа клонирования и возможность одновременного нокаута до четырех различных генов.

Процедуру продемонстрирует Алессандра Меренда, аспирантка моей лаборатории. Клонирование направляющих РНК или гРНК в вектор CRISPR-конкатемера начинается с единой реакции по отжигу верхней и нижней цепей каждого олигонуклеотида гРНК и фосфорилированию их концов. Приготовьте реакционную смесь на льду; для трех конкатемеров используйте 3 µL верхней цепи гРНК, 3 µL нижней цепи гРНК, 2 µL буфера T4 ДНК-лигазы, 1 µL T4-полинуклеотидкиназы и воду до достижения общего объема 20 µL.

Тщательно перемешайте смесь путем пипетирования и запустите термоциклер со следующими настройками: 37 °C в течение 30 минут, 95 °C в течение пяти минут, снижение температуры до 25 °C со скоростью 0,3 °C в минуту и выдерживание при 4 °C. Следующим этапом является реакция перетасовки Bbs1, в ходе которой предварительно отжженные олигонуклеотиды гРНК встраиваются в соответствующие позиции конкатемерного вектора. Разведите реакционную смесь в воде, свободной от ДНК и РНК, в соотношении 1:100 для получения конкатемерных векторов с тремя и четырьмя гРНК.

Подготовьте реакционные смеси для шаффлинга Bbs1 на льду. Используйте 100 nanograms вектора CRISPR-конкатемера, 10 microliters смеси олигонуклеотидов, один microliter буфера для рестриктазы, один microliter DTT, один microliter ATP, один microliter фермента Bbs1, один microliter T7-лигазы и воду до общего объема 20 microliters. Тщательно перемешайте содержимое путем пипетирования; в качестве отрицательного контроля используйте пробу, содержащую только вектор.

Проведите реакции в термоциклере, используя следующие настройки: для клонирования конкатемеров из трех и четырех gRNA выполните 50 циклов при 37 °C в течение пяти минут и 21 °C в течение пяти минут, затем выдержите при 37 °C в течение 15 минут и при 4 °C неопределенно долго. Для конкатемеров из двух gRNA используйте те же настройки, но с 25 циклами на первом этапе. По завершении реакции перетасовки Bbs1 возьмите 11 µL каждой смеси для лигирования и добавьте 1,5 µL буфера для экзонуклеазы, 1,5 µL ATP, 1 µL ДНК-экзонуклеазы и воду до достижения общего объема 15 µL.

Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, затем при 70 °C в течение 30 минут. После этого реакционную смесь используют для трансформации химически компетентных бактерий E. coli согласно стандартному протоколу. Для подтверждения наличия вставок gRNA в CRISPR-конкатемерном векторе отберите бактериальные колонии с помощью инокуляционной петли и инокулируйте каждую в 4 мл среды LB.

Культивируйте клоны в течение ночи при 37 °C на орбитальном шейкере. На следующий день экстрагируйте ДНК с помощью набора для мини-препа плазмид согласно инструкциям производителя. Смешайте приблизительно 200 ng каждого образца ДНК с 10 U EcoR1 и 5 U BglII в реакционной смеси объемом 10 µL.

Для сравнения размеров в качестве положительного контроля используйте отдельную реакционную смесь с соответствующим исходным вектором. Инкубируйте смеси при 37 °C в течение трех часов. Проведите электрофорез продуктов рестрикции в 1% агарозном геле при 90 В в течение примерно 20 минут.

Визуализируйте гель с помощью УФ-трансиллюминатора, чтобы определить клоны с вставкой правильного размера. Чтобы подтвердить, что гРНК были клонированы в нужную позицию и, следовательно, все сайты распознавания Bbs1 были утрачены, проведите рестрикцию отобранных клонов с использованием пяти единиц Bbs1. В качестве контроля подготовьте отдельную реакционную смесь с соответствующим исходным вектором.

Инкубируйте при 37 °C в течение трех часов, затем проведите электрофорез продуктов реакций дигестии в 1% агарозном геле при напряжении 90 В в течение примерно 20 минут. Визуализируйте гель с помощью УФ-трансиллюминатора, чтобы определить векторы, которые не были разрезаны Bbs1. При разделении органоидов для электропорации высевайте минимум в шесть лунок 48-луночного планшета на одну трансвекцию.

Посейте органоиды в капли базального матрикса объемом 20 µL и культивируйте их в 250 µL среды WENR с никотинамидом на лунку при 37 °C и 5% CO2 в увлажненном инкубаторе. На второй день замените среду WENR с никотинамидом на 250 µL среды с EGF, noggin, ингибитором GSK3 и ингибитором ROCK без антибиотиков. На третий день замените среду для органоидов на среду с EGF, noggin, ингибитором GSK3, ингибитором ROCK и 1.25% DMSO без антибиотиков.

На четвертый день разрушьте купола базального матрикса с помощью наконечника дозатора на 1 мл и перенесите органоиды в пробирку объемом 1,5 мл. Соберите содержимое четырех лунок планшета на 48 лунок в одну пробирку. Механически раздробите органоиды на мелкие фрагменты, выполнив примерно 200 циклов пипетирования вверх-вниз с помощью дозатора P200.

Центрифугируйте при 600 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования удалите среду из всех пробирок и ресуспендируйте осадки в 1 mL рекомбинантной протеазы культурального качества. Инкубируйте при 37 °C не более пяти минут.

Важно тщательно контролировать обработку протеазой, поскольку успех электропорации зависит от получения клеточной суспензии, содержащей скопления клеток, а не одиночные клетки. Осмотрите каплю образца объемом 50 µL под инвертированным световым микроскопом с использованием объектива с четырехкратным увеличением. Желательно получить скопления из 10–15 клеток, так как это повышает выживаемость клеток после электропорации.

Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров с низкой адсорбцией и остановите диссоциацию, добавив девять миллилитров базальной среды без антибиотиков. Центрифугируйте при 600 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре среды с пониженным содержанием сыворотки.

Подсчитайте количество клеток с помощью камеры Бёркса; для одной реакции электропорации требуется минимум 1 × 10⁵ клеток. Начните процедуру с добавления 9 мл среды с пониженным содержанием сыворотки в пробирку объемом 15 мл с суспензией клеток, затем центрифугируйте при 400 ×g в течение трех минут при комнатной температуре. Удалите весь супернатант и ресуспендируйте осадок в растворе для электропорации.

Добавьте по 10 мкг ДНК в две новые пробирки. Затем добавьте раствор для электропорации до конечного объема 100 мкл и держите смесь клеток и ДНК на льду. Перенесите смесь клеток и ДНК в кювету для электропорации, затем поместите кювету в камеру электропоратора.

Измерьте импеданс, нажав соответствующую кнопку на электропораторе, и убедитесь, что его значение составляет от 0,030 до 0,055 ohm. Проведите электропорацию в соответствии с настройками, указанными в текстовом протоколе. Добавьте в кювету 400 µL буфера для электропорации с ингибитором ROCK, а затем перенесите всё содержимое в пробирку объемом 1,5 mL.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут для восстановления клеток. Через 30 минут центрифугируйте при 400 ×g в течение трех минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 20 µL базисной матрицы на лунку.

Рассейте примерно 1 × 10⁴–1 × 10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет и добавьте среду, содержащую EGF и noggin, ингибитор GSK3, ингибитор ROCK и 1,25% диметилсульфоксида. Инкубируйте при 37 °C. На следующий день замените среду на среду с EGF и noggin, ингибитором GSK3 и ингибитором ROCK, затем проверьте эффективность трансфекции по экспрессии GFP.

Поддерживайте органоиды при температуре 37 °C. Через два дня замените среду на свежую. Через четыре дня после электропорации замените среду на среду WENR с добавлением никотинамида и ингибитора ROCK и продолжайте инкубацию клеток при 37 °C.

Наличие правильного количества вставок гРНК в конкатемерном векторе подтверждают двойным рестрикционным расщеплением с помощью EcoR1 и BglII. Ожидаемый размер нижней полосы составляет примерно 1.6 kilobase для конкатемерного вектора с четырьмя гРНК и 1.2 kilobase для конкатемерного вектора с тремя гРНК. Кроме того, расщепление с помощью Bbs1 подтверждает, что гРНК были клонированы в правильное положение и, следовательно, все сайты распознавания Bbs1 утрачены.

Подтвержденные конструкции доставляются в кишечные органоиды мыши путем электропорации для достижения эффективности трансфекции до 70%, что подтверждается экспрессией GFP. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать векторы с конкатемерами gRNA и как эффективно доставлять их в 3D-культуры органоидов с помощью электропорации для одновременного нокаута нескольких генов.