Количественное определение на основе конъюгированных наночастиц антител с использованием микроскопии в темном поле: процедура захвата и количественного определения конкретных экзосом из жидкостей организма

Экзосомы представляют собой небольшие структуры, окруженные мембраной, которые секретируются клетками во внеклеточное пространство. Экзосомы в изобилии присутствуют в биожидкостях.

Чтобы идентифицировать и захватить конкретные экзосомы из жидкостей организма, начните с многолуночного иммунологического анализа. Это предметное стекло функционализировано белками, которые действуют как антигены и связываются со специфическими антителами.

Дополните предметное стекло нужным первичным раствором антител и инкубируйте. Эти антитела связываются с предварительно покрытыми антигенами на поверхности предметного стекла.

Аспирируйте оставшийся раствор, чтобы удалить все несвязанные антитела. Теперь добавьте блокирующий буфер, который блокирует свободные антигены, тем самым предотвращая неспецифическое связывание экзосом.

Затем извлеките блокирующий буфер, загрузите экзосомы, содержащие сывороточную суспензию, на предметное стекло и инкубируйте. Это позволяет осуществлять исключительное связывание специфичных для мишени экзосом с захваченными первичными антителами.

Затем загрузите на поверхность предметного стекла суспензию конъюгированных наночастицами золота вторичных антител. Эти антитела прикрепляются к предварительно связанным экзосомам и образуют комплекс детектирования.

Наконец, с помощью пипетки отбросьте все несвязанные вторичные антитела. Визуализируйте предметные стекла под темнопольным микроскопом. Наночастицы золота, присутствующие на поверхности экзосом, рассеивают свет и проявляются яркими пятнами на темном фоне.

Чтобы начать подготовку предметного стекла, разведите нужные антитела захвата экзосом до 0,025 мг на миллилитр в PBS. Внесите пипеткой 1 микролитр раствора в каждую лунку с обработанным белком A/G предметным стеклом с оптической подложкой. Затем переложите предметное стекло в увлажняющий бокс, чтобы лунки не пересыхали во время инкубации.

Инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа, чтобы обездвижить антитела захвата. Затем аспирируйте оставшийся раствор, чтобы удалить несвязанные антитела. Промойте лунки, добавив и отасунув 1 микролитр PBS три раза. Затем быстро загрузите в каждую лунку 1 микролитр блокирующего буфера на основе PBS и инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов.

При обработке около 15 образцов мы должны использовать одноканальную пипетку, чтобы загрузить рабочий буфер в 120 лунок менее чем за 5 минут, чтобы избежать испарения блокирующего агента.

Начните готовить раствор конъюгированных антителами золотых наностержней во время блокировки слайдов. Примерно за 30 минут до окончания блокировки быстро разморозьте образцы плазмы или сыворотки на водяной бане комнатной температуры. Ввергните размороженные образцы в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что суспензии однородны. Затем центрифугируйте образцы при давлении 500 x g в течение 15 минут, чтобы осадить белковые агрегаты и другой мусор.

Переложите 10 микролитров надосадочной жидкости в свежие пробирки и сделайте разведение один к одному с PBS. Перемешайте разбавленные образцы путем осторожного вортексинга или инверсии, в зависимости от ситуации. Когда блокировка стекла закончится, аспирируйте блокирующий буфер и трижды промойте лунки 1 микролитром PBS. Немедленно загрузите образцы в лунки по 1 микролитру на лунку и по 8 репликациям на пробу.

Таким же образом загрузите стандарты экзосом в соответствующие лунки. Выдержите предметное стекло от 12 до 18 часов в холодильнике при температуре 4 градуса Цельсия. Затем аспирируйте лунки и промойте каждую лунку по одному разу 1 микролитром PBS. Загрузите по 1 микролитру суспензии золотых наностержней, сопряженных с антителами, в каждую лунку и инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов.

После этого аспирировать суспензию наностержней и промыть предметное стекло в PBS с добавлением 0,01% полисорбата-20 в течение 10 минут с помощью миксера. Затем аспирируйте лунки и промойте предметное стекло в деионизированной воде в течение 10 минут на вращающемся миксере. Удалите воду и дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе в чистой чашке Петри, прежде чем подносить предметное стекло к микроскопу темного поля.