Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание
January 7th, 2019
В этом протоколе мы описываем полный рабочий процесс для быстрой изоляции внеклеточного везикулы от человека цельной крови и характеризация конкретных маркеров путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. Представленные результаты показывают высокий уровень воспроизводимости и может быть скорректирована в supernatants культуры клеток.
Этот метод решает общую проблему в полевых условиях и обеспечивает полный рабочий процесс для быстрой изоляции и характеристики отдельных внеклеточных пузырьков с конкретными маркерами интереса. Анализ слежения за наночастицами является полуавтоматическим методом. Он использует свойства рассеяния света и броуианского движения для анализа распределения размеров внеклеточных пузырьков.
Демонстрацией процедуры будет Вера Шмидт, аспирантка нашей лаборатории. Чтобы изолировать внеклеточные пузырьки, после сбора двух миллилитров образцов всей крови человека в сыворотке,-отделяющих трубки, позволяют образцам свертывать в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем отделить клетки от сыворотки центрифугации. Перенесите один миллилитр сыворотки из каждого образца в отдельные 1,5 миллилитровые реакционные трубки для центрифугации для удаления тромбоцитов и перенесите 100 микролитров плазмы с тромбоцитов в новые 1,5 миллилитровые реакционные трубки.
Далее добавьте 25 микролитров раствора экзосомных осадков в плазму и тщательно вихревые образцы. После 30-минутной инкубации на льду соберите внеклеточные пузырьки путем центрифугации. Гранулы будут отображаться как бежевый или белый цвет.
Аспирировать супернатант и центрифугировать образец снова. Затем удалите все трансы жидкости и повторно помесить гранулы в 100 микролитров PBS. Чтобы испачкать клеточные мембраны пузырьков, добавьте 10 микролитров подвески EV в 50 микролитров свежеприготовленного раствора этанолового красителя PKH67 и тщательно перемешайте.
Через пять минут при комнатной температуре в темноте разбавьте 50 микролитров окрашенной внеклеточной суспензии с 2,5 миллилитров дистиллированной воды в 15-миллилитровой конической трубке с тщательным смешиванием. Чтобы обозначить пузырьки антителами, разбавьте от 10 до 20 микролитров неотренимной внеклеточной суспензии с 50 микролитров дистиллированной воды в 1,5 миллилитровой реакционной трубке с тщательным смешиванием. Добавьте от 2,5 до 5 микролитров антител, представляющих интерес для реакционной трубки, с тщательным смешиванием, для 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте.
Затем перенесите 50 микролитров помеченных пузырьков в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую соответствующий экспериментальный объем дистиллированной воды, с тщательным смешиванием, как указано в таблице. Прежде чем анализировать окрашенные или помеченные внеклеточные пузырьки, сначала перемести фильтр флуоресценции в оптический путь микроскопа и камеры, и запустите программу, следуя инструкциям на экране для автоматизированной реализации. Под вкладкой Проверка клеток, выберите правильный номер клетки для измерения флуоресценции и эталонного положения для оптики, чтобы подтвердить, что лазер и микроскоп находятся в общем фокусе.
Используйте шприц, чтобы промыть клеточный канал с 10 миллилитров дистиллированной воды, заботясь о том, что измерительные клетки свободны от пузырьков воздуха и что пузырьки воздуха не вводятся в систему. Далее разбавляют 10 микролитров 200-нанометрового размера флуоресценцией, помеченными полистиролом частицами в 990 микролитров дистиллированной воды, и добавляют 10 микролитров этой частицы суспензии в 15 миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров дистиллированной воды. Затем ввините 2,5 миллилитров раствора первой разбавленной частицы в клеточный канал и нажмите Optimize Focus, чтобы настроить камеру.
Чтобы измерить образец, промыть клеточный канал несколько раз с 10 миллилитров дистиллированной воды и ввести окрашенные внеклеточной подвески пузырьков. Используя эталонную позицию, отрегулируйте соответствующие параметры приобретения под вкладкой Cell Check, как указано в таблице. Чтобы определить оптимальный диапазон чувствительности, нажмите Number of Particles vs.
Чувствительность, для отображения кривой измеренных частиц на экран для различных уровней чувствительности. Для параметра Затвора отрегулируйте период времени, в течение которого камера позволяет свету проходить в течение определенного интервала. Для параметров Postacquisition выберите минимальную яркость 20, минимальный размер 20 нанометров и максимальный размер измерения 500 нанометров.
Обратите внимание на количество обнаруженных частиц в поле зрения дисплея. Бар рассеяния должен быть от зеленого до оранжевого, от 50 до 300 частиц диапазона. Нажмите Проверьте дрейф частиц в нулевом вольте и откройте вкладку Измерения.
Нажмите Run Video Acquisition и установите количество экспериментов до трех-пяти, а задержку времени между экспериментами до нуля минут. Установите количество отдельных субтомных позиций до 11 и количество циклов измерений до 10 в каждом измерительных позициях, в которых должны быть проанализированы частицы. Затем выберите папку, создайте новое имя файла и нажмите Кнопку Хорошо, чтобы начать измерение.
В конце анализа откройте вкладку «Анализ» для проверки результатов. Затем проверьте среднее количество частиц на позицию, общее количество отслеживаемых частиц и концентрацию частиц, ширину распределения частиц, значение среднего и стандартное отклонение. Использование флуоресцентных бусин для регулировки и калибровки измерения дает оптимальную чувствительность настройки 85% Использование этих параметров, камера отображает резкое изображение и повторные измерения демонстрируют низкое стандартное отклонение.
Окрашивание с набором сотового связующих, который включает в себя флуоресцентный клеточный связующий, который включает в себя зеленый флуоресцентный краситель с длинными, алифатными хвостами в липидные области клеточной мембраны, показывает сильную корреляцию между чувствительностью и количеством измеренных частиц. Внеклеточное окрашивание пузырьков антителом к интересному белку указывает на распределение частиц от 220 до 1 145 нанометров, с максимальным максимальным размером 541 нанометров. Никакие внеклеточные пузырьки не обнаруживаются после окрашивания антителами воды, свободной от пузырьков, до чувствительности, близкой к 100%, если измерение начато, когда дрейф превышает 5 микрометров в секунду, отдельные повторения демонстрируют явные отклонения.
Важно отметить, что использование фторсхейна изотиоцианата в качестве фторхрома приводит к неточным и невоспроизводимым измерениям, так как этот фторфор склонен к быстрому фототравмингу. Этот протокол отвечает ведущему спросу многих исследователей в этой области на быструю характеристику одиночных внеклеточных пузырьков с использованием определенных маркеров. Несмотря на то, что за последнее десятилетие методы значительно улучшились, до сих пор нет стандартизированного протокола для анализа отдельных внеклеточных пузырьков.
Независимо от будущего прогресса исследований по внеклеточной биологии пузырьков, этот метод обеспечивает быстрый и надежный протокол для характеристики одиночных внеклеточных пузырьков с использованием конкретных маркеров. Поскольку наши текущие протоколы не предполагают длительного времени обработки или трудоемких шагов, они также подходят для высокой пропускной способности выборки.
Обзор
Этот протокол описывает полный рабочий процесс для быстрой изоляции и характеристики внеклеточных везикул из донорской крови человека. Метод использует флуоресцентный наночастицевый анализ для определения специфических маркеров, демонстрируя высокую воспроизводимость и адаптивность для супернатантов клеточной культуры.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Внеклеточные везикулы
Предисловие
- Внеклеточные везикулы играют важную роль в межклеточной связи.
- Изоляция и характеристика этих везикул необходимы для понимания их функций.
- Существующие методы могут быть неэффективными и нестойкими.
- Этот протокол направлен на решение этих проблем.
Цель исследования
- Предоставить надежный метод для изоляции внеклеточных везикул из донорской крови человека.
- Характеризовать эти везикулы с использованием флуоресцентных методов.
- Улучшить понимание биологии внеклеточных везикул.
Использованные методы
- Сбор образцов донорской крови человека.
- Центрифугирование для разделения клеток от сыворотки.
- Использование раствора для осадки экзосомы для изоляции везикул.
- Флуоресцентное окрашивание и наночастицевый анализ для характеристики.
Основные результаты
- Успешная изоляция внеклеточных везикул с видимым осадком.
- Характеристика везикул показала диапазон размеров и наличие специфических маркеров.
- Высокая воспроизводимость измерений в нескольких экспериментах.
- Демонстрируется корреляция между окрашиванием и чувствительностью обнаружения частиц.
Выводы
- Протокол предоставляет надежный метод для анализа внеклеточных везикул.
- Результаты указывают на то, что метод можно адаптировать для различных типов образцов.
- Этот подход повышает потенциал для будущих исследований в области биологии внеклеточных везикул.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Rapid fluorescence-based characterization of single extracellular vesicles (EVs) from human blood addresses a critical bottleneck in biomarker discovery and target validation workflows. By enabling reproducible, marker-specific analysis of EVs in clinically relevant fluids, the method supports early-stage mechanistic de-risking and improves predictive confidence in liquid biopsy applications. This capability enhances portfolio triage by providing quantitative, standardized data for go/no-go decisions in preclinical target programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific surface marker detection (e.g., CD63, CD9, vimentin, LAMP-1) on single EVs from human serum.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating fluorescence staining with particle detection sensitivity, supporting functional target validation.
- Predictive Value: High reproducibility across experiments, confirmed by orthogonal methods like Western blotting, increases confidence in early target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs including particle concentration, size distribution (220–1,145 nm), and mean/standard deviation metrics for downstream compound screening.
- Scalability: Semi-automated nanoparticle-tracking analysis with optimized acquisition parameters (e.g., 85% sensitivity, 20 nm minimum brightness) enables high sample throughput and platform reuse.
- Reproducibility: Consistent results across multiple experiments and sample types (serum, plasma, cell culture supernatants) support assay standardization in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Characterization of EVs from human blood provides a disease-relevant system for bridging discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Reliable detection of specific markers (e.g., via antibody staining) enables biomarker-aligned decision-making in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Avoids unreliable fluorophores (e.g., FITC) prone to photobleaching, ensuring data integrity for target mechanism studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for liquid biopsy and biomarker-driven programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling specific marker profiling of EVs isolated from human whole blood.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative EV characterization data (size, concentration, marker presence) for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates traceable particle measurements, distribution width, and sensitivity curves that allow cross-condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of human-derived EVs and disease-relevant markers like vimentin and LAMP-1.
- Enterprise Reuse: Semi-automated workflow and adaptability to plasma, serum, and cell culture supernatants position the method as a scalable, reusable capability across teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reproducible, marker-specific single EV analysis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced hands-on time via semi-automated nanoparticle-tracking analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative EV marker data from human blood samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence staining, nanoparticle-tracking analysis, and EV isolation techniques.
- Dependent on instrumentation capable of fluorescence detection, light-scattering measurement, and automated video acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols (e.g., PKH67, antibody dilution) and acquisition parameters (sensitivity, shutter, subvolume positions).
- Adaptation considerations include adjusting antibody concentration (10–20 μL) and incubation time (30 min) for different markers across model systems.
- Practical limitation: Avoid fluorescein isothiocyanate (FITC) due to rapid photobleaching, which compromises measurement accuracy and reproducibility.
