Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы

Общая цель этого метода заключается в получении данных корреляционной световой и электронной микроскопии, или CLEM, путем объединения флуоресцентной иммуноцитохимической информации с ультраструктурной морфологией просвечивающей электронной микроскопии в одном изображении. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммуноцитохимии и патологии, например, с какой субклеточной структурой связан тот или иной белок, представляющий интерес. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует один и тот же зонд наночастиц на квантовых точках для получения как живого сигнала микроскопа от целевого белка, так и структурной локализации электронной микроскопии.

После фиксации, встраивания и разрезания опухолевой ткани соматостатиномы человека согласно текстовому протоколу приготовьте срез адгезивного раствора, поместив 20 сантиметров прозрачной клейкой ленты в пятимиллилитровый флакон, содержащий 2,0 миллилитров ацетона, и дайте ему постоять 10 минут. Снимите ленту и окуните в раствор никелевую сетку, затем снимите сетку и дайте ей высохнуть на воздухе. После высыхания используйте тусклую сторону сетки, чтобы выбрать ультратонкий участок.

Очень важно установить правильное время травления для выбранного состава смолы. 30 минут хорошо подходит для этого состава, но для более твердых или мягких составов может потребоваться пересчет. Приготовьте один миллилитр свежего раствора для травления насыщенного метапериодата натрия в дистиллированной воде и поместите капли раствора на чистую поверхность лабораторной пленки.

На капли выложите полностью сухие сетки со срезами и выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем переложите решетки на капли дистиллированной воды на 60 секунд, чтобы смыть их. Для проведения мечения антителами и квантовыми точками, или квантовыми точками, на чистой поверхности лабораторной пленки пипеткой капают 0,05 молярного гликола и PBS.

Поместите сетки на капли и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы заблокировать остаточный альдегид на срезах. Чтобы удалить блок альдегида, кратковременно промокните край сетки. Затем поместите сетку на каплю одного процента обычной козьей сыворотки, или NGS, и одного процента BSAC в PBS на 10 минут.

Приготовьте один миллилитр блокирующего раствора, добавив 10 микролитров NGS и 100 микролитров BSAC к 890 микролитрам PBS. Затем кондиционируйте срезы, поместив их на каплю разбавителя антител на 10 минут. Затем с помощью разбавителя антител разбавьте поликлональные антитела против соматостатина от одного до 10 и поместите сетки на капли раствора.

Выдерживать во влажной камере при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации удалите реагент антитела, промокнув край сетки. Затем с помощью разбавителя антител промыть участки два раза по пять минут каждый.

Разведив вторичное антитело один к 10 и приготовив капли, инкубируйте сетки на каплях при комнатной температуре в течение одного часа. Затем удалите раствор антитела и промойте срезы два раза. Разведите стрептавидин конъюгированные КТ от одного до 10 и инкубируйте образцы на каплях раствора в темноте, при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем с помощью разбавителя антител промыть сетки дважды, каждый раз в течение пяти минут, и промокните край сетки. Далее промойте сетки в дистиллированной воде в течение двух минут, перед промоканием обсушите края. Поместите окрашенный иммуновитамином участок сетки в каплю воды на предметное стекло и накройте его стеклопакетом.

Для проведения флуоресцентной световой микроскопии необходимо вставить фильтрующий куб со следующими характеристиками и использовать светодиодную подсветку 365 нанометров. Поместите окрашенный иммуновирусом срез на предметный столик иммунофлуоресцентного микроскопа. Используйте световую микроскопию, чтобы оценить характер мечения, уровень любого неспецифического мечения и установить, что отрицательный контроль является четким.

Затем определите ROI по отношению к столбцам сетки. Затем установите полноцветную цифровую камеру в режим автоматического цвета FL и установите баланс белого на 3, 200 K. Установите камеру в автоматический режим экспозиции с настройкой гаммы от 0,45 до 1,00 для оптимизации внешнего вида изображений, а аналоговое усиление установите на один X. Нажмите на значок камеры в графическом интерфейсе программного обеспечения ZEN Two Light, чтобы начать жить. Затем сфокусируйтесь на изображении и нажмите «Привязать» в графическом интерфейсе программного обеспечения ZEN Two Light, чтобы захватить изображение в хранилище кадров.

Сохраните изображения в виде файлов tf, чтобы избежать сжатия и пикселизации. Подготовьте распечатку, показывающую положение ROI по отношению к столбцам сетки или другим значимым ориентирам ткани. Затем снимите сетку с горки, промойте в дистиллированной воде и аккуратно промокните края насухо.

Для проведения просвечивающей электронной микроскопии необходимо передать сетку в микроскоп для исследования с помощью ускоряющего напряжения 100 киловольт. Начните с малого увеличения примерно в 1 400 раз, чтобы перемещаться по сетке и находить ROI вместе с теми, которые были обнаружены с помощью световой микроскопии. Наблюдайте за отдельными квантовыми точками при увеличении 70 000X или выше.

Они будут проявляться в виде неправильных кристаллических структур с умеренной электронной плотностью. Затем, используя цифровую камеру с монохромным сенсором размером 1,392 на 1,040 пикселей в графическом интерфейсе программного обеспечения для обработки изображений, нажмите на значок камеры, чтобы включить его и получить изображение. Переместите значок камеры в положение «выкл.», чтобы сохранить изображение в хранилище кадров.

Чтобы выполнить визуализацию CLET, используйте отпечаток световой микроскопии, чтобы найти соответствующие ROI с помощью TEM. Особенности архитектуры тканей полезны для навигации по разделу. Захват изображения соответствующего ROI с помощью TEM.

Затем, чтобы подготовить изображение CEM, убедитесь, что изображение TEM правильно ориентировано и увеличено до того же размера и разрешения, что и изображение светового микроскопа, в данном случае 300 пикселей на дюйм. Увеличьте размер холста изображения световой микроскопии, чтобы удвоить его размер. Затем скопируйте и вставьте изображение TEM рядом с флуоресцентным изображением.

Чтобы создать флуоресцентное наложение в Photoshop CS2, нажмите на инструмент прямоугольной области, выберите флуоресцентное изображение и создайте из него дубликат слоя. Установите параметры наложения стилей слоя на прозрачность от 30 до 40%. Затем нажмите на инструмент перемещения, перетащите слой наложения флуоресценции на соответствующее изображение TEM и выровняйте изображения.

После выравнивания изображений сведите изображение, чтобы получить окончательное наложение. Затем с помощью инструмента прямоугольной области выберите новое наложенное изображение и скопируйте его на новый холст. Наконец, сохраните изображение в виде файла tf.

На этом изображении флуоресцентной микроскопии отдельные опухолевые клетки соматостатиномы содержат большое количество секреторных гранул и были положительно помечены для гормона соматостатина. Ядра выглядели как темные дыры, и при малом увеличении в цитоплазме наблюдалась переменно интенсивная зернистая оранжевая флуоресценция оранжевой квантовой точки. ROI, выбранный с помощью световой микроскопии, был распознан и визуализирован с помощью TEM с помощью изображения 20-кратной световой микроскопии, как показано здесь.

При большем увеличении клетка демонстрирует яркую флуоресценцию и интенсивное мечение QD в цитоплазматических гранулах. Наложение флуоресцентных данных на изображения ПЭМ, как в этом примере, позволяет предположить, что сильная положительная маркировка соответствует гранулам, содержащим умеренно электронно-плотный материал внутри везикулы, ограничивающей мембрану. Наконец, как видно здесь при более высоком увеличении, умеренно электронно-плотные гранулы показали интенсивную иммуномаркировку нанокристаллов QD.

После освоения этой техники ее можно выполнить за восемь часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что с сетками нужно обращаться аккуратно, только за края. Прикосновение к секции во время взятия сетки может отсоединить секцию от сетки.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как мультиплексное иммуномечение, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, колокализуется ли интересующий вас белок с другим белком. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области патологии к изучению локализации белков в архивных тканях человека для электронной микроскопии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как объединить иммуноцитохимическую информацию, полученную при флуоресцентной световой микроскопии, с ультраструктурой, полученной методом просвечивающей электронной микроскопии.

Не забывайте, что работа с тетраоксидом осмия может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры следует соблюдать такие меры предосторожности, как ношение защитного снаряжения, работа в вытяжном шкафу и правильная утилизация отходов.