Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы

Общая цель данного метода заключается в получении данных корреляционной световой и электронной микроскопии (CLEM) путем объединения данных флуоресцентной иммуноцитохимической визуализации с ультраструктурной морфологией, полученной с помощью просвечивающей электронной микроскопии, на одном изображении. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммуноцитохимии и патологии, например, с какой субклеточной структурой связан конкретный интересующий белок. Основным преимуществом данной методики является использование одного и того же зонда на основе наночастиц квантовых точек для получения как сигнала флуоресцентной микроскопии от целевого белка, так и структурной локализации при электронной микроскопии.

После фиксации, заливки и изготовления срезов ткани опухоли соматостатиномы человека согласно текстовому протоколу, приготовьте адгезивный раствор для срезов, поместив отрезок прозрачной клейкой ленты длиной 20 сантиметров во флакон объемом пять миллилитров, содержащий 2,0 миллилитров ацетона, и выдержав в течение 10 минут. Извлеките ленту и погрузите никелевую сетку в раствор, затем выньте сетку и дайте ей высохнуть на воздухом. После высыхания используйте тупую сторону сетки, чтобы поднять ультратонкий срез.

Крайне важно установить правильное время травления для выбранного состава смолы. Для данного состава хорошо подходит 30 минут, однако это время может потребоваться пересчитать для более твердых или мягких составов. Приготовьте один миллилитр свежего насыщенного раствора метапериодата натрия для травления в дистиллированной воде и нанесите капли раствора на чистую поверхность лабораторной пленки.

Поместите полностью сухие сетки со срезами на капли и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем перенесите сетки в капли дистиллированной воды на 60 секунд для промывки. Для проведения маркировки антителами и квантовыми точками (QD) на чистой поверхности лабораторной пленки нанесите пипеткой капли 0,05 M глицина и PBS.

Поместите сетки на капли и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы заблокировать остаточный альдегид на срезах. Чтобы удалить альдегидный блок, осторожно промокните край сетки. Затем поместите сетку на каплю 1% нормальной сыворотки козы (NGS) и 1% BSAC в PBS на 10 минут.

Приготовьте один миллилитр блокирующего раствора, добавив 10 µL NGS и 100 µL BSAC к 890 µL PBS. Затем подготовьте срезы, поместив их в каплю разбавителя антител на 10 минут. Далее разведите поликлональный анти-соматостатин антитело в разбавителе антител в пропорции 1:10 и поместите сетки в капли полученного раствора.

Инкубируйте в увлажненной камере при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации удалите реагент с антителами, промакнув край сетки. Затем дважды промойте срезы разбавителем для антител по пять минут за каждую промывку.

После разведения вторичного антитела в пропорции 1:10 и подготовки капель инкубируйте сетки в каплях при комнатной температуре в течение одного часа. Затем удалите раствор антител и промойте срезы дважды. Разведите квантовые точки (QDs), конъюгированные со стрептавидином, в пропорции 1:10 и инкубируйте образцы в каплях данного раствора в темноте при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем дважды промойте сетки разбавителем для антител, по пять минут каждый раз, и промокните края сеток. Далее промойте сетки в дистиллированной воде в течение двух минут, после чего промокните края насухо. Поместите иммуноокрашенный участок сетки в каплю воды на предметное стекло и накройте его покровным стеклом.

Для проведения флуоресцентной микроскопии установите фильтр-куб со следующими характеристиками и используйте светодиодное освещение с длиной волны 365 нанометров. Поместите иммуноокрашенный срез на предметный столик иммунофлуоресцентного микроскопа. Используйте световую микроскопию для оценки паттерна маркировки, уровня неспецифического окрашивания и подтверждения чистоты негативных контролей.

Затем определите области интереса (ROI) относительно линий сетки. После этого переведите полноцветную цифровую камеру в режим FL auto color и установите баланс белого на 3 200 K. Переведите камеру в режим автоматической экспозиции с настройкой гаммы от 0,45 до 1,00 для оптимизации внешнего вида изображений, а аналоговое усиление установите на 1X. Нажмите на иконку камеры в графическом интерфейсе программного обеспечения ZEN Two Light для перехода в режим просмотра в реальном времени. Затем сфокусируйте изображение и нажмите Snap в графическом интерфейсе ПО ZEN Two Light, чтобы сохранить изображение в памяти кадров.

Сохраняйте изображения в формате tf-файлов, чтобы избежать сжатия и пикселизации. Подготовьте распечатку, на которой указано положение ROI относительно линий сетки или других значимых ориентиров ткани. Затем снимите сетку со слайда, промойте его дистиллированной водой и аккуратно промокните края насухо.

Для проведения просвечивающей электронной микроскопии перенесите сетку в микроскоп для исследования при ускоряющем напряжении 100 киловольт. Начните с низкого увеличения (примерно 1 400X), чтобы сориентироваться на сетке и найти области интереса (ROI), которые были определены при световой микроскопии. Наблюдайте за отдельными КТ в увеличении 70 000X или выше.

Они будут выглядеть как неправильные кристаллические структуры с умеренной электронной плотностью. Затем, используя цифровую камеру с монохромным сенсором 1 392 на 1 040 пикселей в графическом интерфейсе программного обеспечения для визуализации, нажмите на значок камеры, чтобы включить её, и получите изображения. Переведите значок камеры в положение «выкл», чтобы сохранить изображение в хранилище кадров.

Для проведения визуализации методом CLEM используйте распечатку изображения, полученного при световой микроскопии, чтобы определить соответствующие области интереса (ROI) с помощью ПЭМ. Особенности архитектуры ткани полезны для навигации по срезу. Снимите изображение соответствующей области интереса с помощью ПЭМ.

Затем, для подготовки изображения CLEM, убедитесь, что изображение ТЕМ правильно ориентировано и увеличено до того же размера и разрешения, что и изображение с светового микроскопа, в данном случае — 300 пикселей на дюйм. Увеличьте размер холста изображения световой микроскопии в два раза. После этого скопируйте и вставьте изображение ТЕМ рядом с флуоресцентным изображением.

Чтобы создать наложение флуоресцентного изображения в Photoshop CS2, выберите инструмент «Прямоугольная область», выделите флуоресцентное изображение и создайте на его основе дублирующий слой. В параметрах наложения стиля слоя установите прозрачность от 30 до 40%. Затем выберите инструмент «Перемещение», перетащите слой с флуоресцентным наложением на соответствующее ПЭМ-изображение и совместите изображения.

После выравнивания изображений выполните сведение слоев, чтобы создать окончательное наложение. Затем с помощью инструмента «Прямоугольная область» выделите полученное наложенное изображение и скопируйте его на новый холст. В завершение сохраните изображение в формате tf.

На данном изображении, полученном с помощью флуоресцентной микроскопии, отдельные опухолевые клетки соматостатиномы содержат большое количество секреторных гранул и были положительно маркированы на гормон соматостатин. Ядра выглядят как темные отверстия, а при малом увеличении в цитоплазме наблюдается гранулярная флуоресценция квантовых точек (QD) оранжевого цвета различной интенсивности. Область интереса (ROI), выбранная с помощью световой микроскопии, была идентифицирована и визуализирована с помощью ПЭМ, ориентируясь на изображение световой микроскопии с 20-кратным увеличением, как показано здесь.

При большем увеличении в клетке наблюдается яркая флуоресценция и интенсивное мечение квантовыми точками (QD) в цитоплазматических гранулах. Наложение данных флуоресценции на изображения ПЭМ, как в данном примере, позволяет предположить, что сильное положительное мечение соответствует гранулам, содержащим умеренно электронно-плотный материал внутри limiting membrane везикулы. Наконец, как видно здесь при большем увеличении, умеренно электронно-плотные гранулы продемонстрировали интенсивное иммуномечение нанокристаллами QD.

После освоения эта техника может быть выполнена за восемь часов при правильном подходе. При выполнении процедуры важно помнить о необходимости осторожного обращения с сетками, держа за них только за края. Прикосновение к срезу во время захвата сетки может привести к отделению среза от нее.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как мультиплексное иммуномаркирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, колокализуется ли интересующий вас белок с другим белком. После разработки эта методика позволила исследователям в области патологии изучать локализацию белков в архивных образцах тканей человека, подготовленных для электронной микроскопии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как объединить данные иммуноцитохимического анализа, полученные с помощью флуоресцентной световой микроскопии, с данными об ультраструктуре, полученными с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Не забывайте, что работа с тетраоксидом осмия может быть чрезвычайно опасной; при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты, работа в вытяжном шкафу и надлежащая утилизация отходов.