Инновационный метод для экзосома количественной и измерения размера

Цель этой процедуры состоит в том, чтобы проанализировать экзосомы по их размеру и количественно оценить их с помощью анализа отслеживания наночастиц или прибора NTA с помощью полуавтоматического метода. Это достигается за счет использования этапов дифференциальной центрации для получения гранулы экзосомы из крови человека. Экзосомы ресуспендируют в концентрации, которая заранее определена для количества исходной плазмы для получения соответствующей интенсивности рассеяния.

Во время NTA суспензия затем фильтруется, чтобы отделить экзосомы от более крупных частиц. Затем выполняется калибровка прибора NTA с помощью контрольной суспензии, содержащей частицы полистирола размером 200 нанометров. Затем раствор экзосомы вводится в прибор NTA и выбирается идеальная настройка NTA путем проведения предварительного теста перед проведением окончательного теста.

В конечном итоге можно получить результаты, которые показывают количественную оценку всех измеренных частиц и перечисление частиц по их размерам. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как решение и настройка для каждого приготовленного экзосомного раствора должны выполняться индивидуально для получения наилучших результатов. Измеряемые экзосомы должны быть в концентрации I, чтобы в режиме просмотра в реальном времени отображалось около 600 частиц на экран.

Кроме того, следует провести предварительный тест для определения оптимального диапазона чувствительности для измерения. Высокая настройка чувствительности приводит к визуализации большего количества мелких частиц, а также увеличивает проблемы, связанные с фоновыми шумами. Чтобы начать подготовку экзосом, соберите цельную кровь в трех цитратных пробирках с помощью венепункции в общей сложности девять миллилитров.

Затем налейте кровь в 15-миллилитровую пробирку Falcon, центрифугируйте образец при 1500 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы инициировать отделение клеток от плазмы. Перенесите S nascent в новую 15-миллилитровую трубку Falcon. Затем снова центрифугируйте образец при 2800 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить все клетки из плазмы.

Перенесите бесклеточную плазму или CFP в ультрацентрифугирующие пробирки по одному миллилитру на пробирку. Затем центрифугируйте CFP при 100 000 G в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия для истощения экзосом. Удалите 900 микролитров надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в оставшихся 100 микролитрах в ультрацентрифужной пробирке.

После добавления 900 микролитров центрифуги PBS вы получаете 100 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Как и раньше, удалите 900 микролитров лежачего средства и повторно суспендируйте гранулы с оставшимися 100 микролитрами. Перелейте от пяти до 20 микролитров суспензии Resus в 40 миллилитров дистиллированной воды.

Фильтруйте суспензию через фильтр с яркостью 450 нанометров, чтобы отделить экзосомы от более крупных частиц. Используйте эту окончательную суспензию для измерения частиц, чтобы использовать прибор для отслеживания частиц. Сначала запустите программу, дважды кликнув по значку программы.

Нажимайте на различные вкладки программного обеспечения, чтобы переключаться между ними по всему протоколу. Следуйте инструкциям на экране. Для автоматизированной реализации процедуры запуска установите флажки как для проверки качества ячеек, так и для автоматического выравнивания.

Любой из этих шагов при необходимости можно повторить отдельно, нажав кнопку A или B на вкладке проверки клеток. Поместите стакан под смотровое отверстие для сбора отработанного раствора и не впрыскивайте пузырьки воздуха в систему. Откройте входное и смотровое отверстия анализатора наночастиц или прибора NTA и введите 10 миллилитров дистиллированной воды с помощью шприца в канал клетки через входной порт.

Немедленно закройте впускной и выпускной отверстия, как только будет впрыскиваться последнее количество воды. Убедитесь, что измерительная ячейка не содержит пузырьков воздуха. Выполните проверку качества ячеек, нажав на. Хорошо.

Программное обеспечение отобразит результат качества клеток через несколько секунд, если какие-либо частицы все еще визуализируются на экране просмотра в реальном времени программного обеспечения, или если результат проверки качества только хороший или плохой, повторяйте дистальную инъекцию воды до тех пор, пока оставшиеся частицы не будут удалены из измерительной ячейки L. Кроме того, Повторяйте этот шаг после каждого измерения, чтобы избежать накопления частиц. Затем приготовьте контрольную суспензию, содержащую однородные частицы полистирола размером 200 нанометров. Чтобы выровнять фокусы лазера и микроскопа, добавьте одну каплю концентрата суспензии, предоставленного производителем прибора, в 500 миллилитров дистиллированной воды, в результате чего необходимая концентрация будет рассчитана на 600 плюс-минус 100 частиц на один экран в режиме реального времени.

Введите выравнивающую суспензию в инструмент NTA так же, как это делается для пресса для дистиллированной воды. Ладно начать также выравнивание, которое представляет собой автоматизированную процедуру, с помощью которой система автоматически найдет оптимальное положение двух фокусов. Когда появится запрос о том, что система теперь готова к экспериментам, нажмите «ОК», чтобы начать измерение.

Время от времени очищайте клеточный канал вручную между экспериментами, промывая ячейку 30%-ным раствором этанола. Очищайте канал всякий раз, когда программное обеспечение отображает автоматический отчет об ошибках. Для выполнения измерений системы.

Сначала промойте канал дистиллированной водой перед каждым измерением образца. Затем введите суспензию экзосомы в канал. Следующим шагом является настройка основных параметров в программном обеспечении для регулировки чувствительности.

Найдите оптимальный диапазон чувствительности, щелкнув по сравнению количества частиц с чувствительностью, чтобы отобразить кривую для измеренных частиц на экране для различных уровней чувствительности. Выберите уровень чувствительности перед максимальным наклоном кривой. Более высокий уровень чувствительности позволяет визуализировать больше мелких частиц, но также увеличивает проблемы, связанные с фоновым шумом.

Чтобы настроить минимальную яркость, выберите начальную яркость 20 для измерения экзосом. Чтобы использовать эту функцию в качестве фильтра, отрегулируйте этот параметр таким образом, чтобы он отсеивал сильно рассеивающие свет частицы. Отрегулируйте его вниз, чтобы усилить еженедельные артефакты рассеяния, очень яркую по мере необходимости на протяжении всего эксперимента.

Затем установите цифровой фильтр для устранения пиксельного шума и нежелательных рассеивающих частиц большого размера. Регулируя минимальный и максимальный размер, используйте диапазон от 10 до 500 пикселей для измерения экзосом. Отрегулируйте затвор, изменив период времени, в течение которого камера открыта, установив затвор на 300, что равно 3,3 миллисекунды.

Чтобы настроить параметры считывания в реальном времени, переключайтесь между цифровым и аналоговым режимом просмотра в любой точке, нажав кнопку изображения в реальном времени. На протяжении всего эксперимента. Следите за полосой интенсивности рассеяния, которая отображает состояние насыщенности образца в виде индикатора с цветовой кодировкой.

Не анализируйте экзосомы, если полоса рассеивания красного цвета. Чтобы начать измерение, нажмите на вкладку измерения. Выберите настройки в массиве опций запуска.

Перед каждым захватом выберите проверку движения, повторную проверку дрейфа частиц, выберите количество экспериментов и временную задержку между ними. При необходимости выполните проверку образца. Наконец, нажмите кнопку «Запустить захват видео».

В новом окне определите количество циклов и количество позиций измерения. Подтвердите минимальную продолжительность времени. Частица отслеживается и учитывается как одна отдельная частица.

При установке разрешения видео более низкое разрешение приводит к сокращению продолжительности отслеживания. Наконец, выберите имя файла и нажмите «ОК», чтобы начать измерение. Кривая зависимости количества частиц от чувствительности отображает частицы в одном положении в один момент времени.

Во время автоматического сканирования чувствительности значение чувствительности выбирается до максимального наклона графика. Артефакты не устраняются в этом тестовом эксперименте и могут повлиять на график. Визуализация частиц на экране просмотра в реальном времени полезна для установки правильного значения чувствительности.

Слишком низкое значение приводит к обнаружению небольшого количества частиц. В то время как слишком высокое значение показывает плохое изображение, качественные частицы появляются в виде отдельных точек, хорошо изолированных друг от друга при оптимальном уровне чувствительности. Вкладка результатов после измерения позволяет считывать параметры, включая общее количество отслеживаемых частиц, среднее количество частиц на позицию и концентрацию частиц, а также численное отношение размера частиц к процентному соотношению количества частиц.

График, рассчитанный после измерения, показывает распределение частиц по размеру. Иконки в режиме отображения можно использовать для изменения настроек графика. Кроме того, существуют различные способы анализа экзосом.

Этот метод показывает очень простой и элегантный метод выполнения аналогичного метода анализа в быстром процессе для получения результатов за короткое время. Чтобы сравнить несколько образцов, мы рекомендуем использовать один и тот же уровень разбавления для всех образцов. Все настройки учитывают чувствительность, а разрешение видео может быть изменено впоследствии с помощью набора нескольких аналитических программ.

Таким образом, сравнительный анализ данных, полученных в различных экспериментах по количеству и размеру экзосом, становится доступным в полуавтоматическом режиме.