Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии
28 марта 2014 г.
Анализ наночастиц взаимодействии с определенными субпопуляций иммунных клеток методом проточной цитометрии.
Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении взаимодействий флуоресцентных наночастиц с субпопуляциями первичных иммунных клеток с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем предварительной обработки интересующих клеток наночастицами. На следующем этапе клетки помечаются антителами против специфических для клеток поверхностных маркеров, а затем анализируются с помощью проточной цитометрии.
В конечном счете, взаимодействие наночастиц с отдельными популяциями иммунных клеток может быть измерено. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микроскопия, заключается в том, что с помощью этого метода изменения интенсивности флуоресценции, индуцированные наночастицами, могут быть количественно оценены в неадгезивных клеточных популяциях. В каждую лунку по 12 лунок тарелка.
Затем добавьте по 10 микролитров свежеприготовленной рабочей флуоресцентной суспензии наночастиц диоксида кремния в каждую опытную лунку, добавив в это же время равный объем полной среды в необработанные контрольные лунки. После часовой интернализации при 37 градусах Цельсия перенесите образцы в отдельные 1,5-миллилитровые полипропиленовые пробирки, а затем в течение трех минут уменьшите количество образцов при температуре 6000 G и комнатной температуре, чтобы окрашивать клетки CD 14 с помощью синего цвета. Инкубируйте 100 микролитров каждой клеточной суспензии в 10 микролитрах человеческого антитела в соотношении один к 11 в проточном буфере в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После смывания несвязанного антитела в одном миллилитре проточного буфера ресуспендируют клетки в 200 микролитрах свежего проточного буфера для проточного цитометрического анализа.
Затем, чтобы настроить компенсацию спектрального перелива, откройте окно настроек прибора в программном обеспечении проточной цитометрии, затем получите образец без меченых наночастиц антител на низкой скорости жидкости. Регулировка настроек компенсации в присутствии флуоресцентных наночастиц является самой сложной частью процедуры, поскольку наночастицы могут мешать боковому рассеянию. Затем нарисуйте достаточно большой вентиль вокруг желаемой популяции клеток.
Загрузите еще один непомеченный образец и откройте вкладку компенсации в окне настроек инструмента. Регулируйте коэффициент компенсации во время сбора данных до тех пор, пока интенсивность флуоресценции в канале распространения не станет примерно одинаковой для положительной и отрицательной популяций флуорохрома. Наконец, после корректировки компенсации для каждой окрашенной контрольной пробирки с флуорохромом, чтения образцов, обработанных наночастицами, чтобы лучше охарактеризовать поведение лейкоцитов в ответ на наночастицы, были проведены анализы интернализации, как показано только что продемонстрировано.
Например, в этом репрезентативном эксперименте три основные субпопуляции лейкоцитов крови были четко идентифицированы по прямому и боковому рассеянию после выделения PBMC. Кроме того, после обработки диоксидом кремния лимфоциты, моноциты и гранулоциты демонстрировали различную скорость интернализации наночастиц, на что указывает их интенсивность флуоресценции. На этих изображениях интернализация наночастиц демонстрируется в первичных CD 14 положительных моноцитах, выделенных из pbmc.
Эти диаграммы рассеяния отображают CD14 положительные моноциты в присутствии наночастиц диоксида кремния Фитца. Гистограмма иллюстрирует количественную оценку фитзи-положительных клеток, выраженную в виде интенсивности флуоресценции. Аналогичные эксперименты по интернализации были проведены с моноцитами TP one, обработанными возрастающими концентрациями наночастиц диоксида кремния Фитца с необработанными клетками в качестве негативного контроля.
Точечные графики иллюстрируют дозозависимое увеличение бокового рассеяния при неизменном прямом рассеянии в одной клеточной линии TP после интернализации наночастиц. Данные из этих графиков свидетельствуют о том, что обработка наночастицами диоксида кремния Fitz индуцирует дозозависимую интернализацию в моноцитах, что подчеркивается усилением внутриклеточной зернистости Чтобы получить более глубокое понимание взаимодействий между иммунными клетками и наночастицами, микроглии культивировали в течение семи дней in vitro и инкубировали с наночастицами в течение одного часа. Флуоресцентная микроскопия показала смешанную культуру первичных глиальных клеток с большим количеством GFP-отрицательных неадгезивных астроцитов и некоторыми GFP-положительными клетками.
В этом репрезентативном эксперименте с помощью проточной цитометрии можно было различить три глиальные субпопуляции с одним антителом CD 11 B, окрашивающим CD 11 B, отрицательными GFP-негативными астроцитами и другими глиальными клетками, микроглиальными CD 11 B положительными GFP-отрицательными клетками и CD 11 B положительной GFP-положительной субпопуляцией. Последние две субпопуляции способны интернализировать наночастицы с несколько повышенным дефицитом в GFP-положительной популяции. Интернализация наночастиц может быть дополнительно проверена с помощью конфокальной микроскопии, как показано на этом изображении с использованием наночастиц диоксида кремния палочкового домина.
При попытке пройти эту процедуру важно помнить о хранении образцов в темноте, чтобы избежать обесцвечивания флуоресцентных красителей и сохранять температуру в четыре градуса во время инкубации антител. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как конфокальная микроскопия, чтобы ответить на дополнительный вопрос о внутриклеточной локализации наночастиц.
Обзор
Данное исследование посвящено изучению взаимодействия флуоресцентных наночастиц с субпопуляциями первичных иммунных клеток с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет количественно оценить интернализацию наночастиц в различных иммунных клетках, что дает представление об их поведении.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Нанотехнологии
- Проточная цитометрия
Теоретическая база
- Наночастицы могут быть использованы для изучения взаимодействий иммунных клеток.
- Проточная цитометрия обладает преимуществами по сравнению с микроскопией при количественном определении флуоресценции.
- Понимание механизмов интернализации наночастиц может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- Различные типы иммунных клеток могут проявлять разную реакцию на наночастицы.
Цель исследования
- Для анализа взаимодействия наночастиц с субпопуляциями иммунных клеток.
- Для количественного определения скорости интернализации наночастиц в различных типах клеток.
- Для более глубокого понимания иммунного ответа на терапию наночастицами.
Используемые методы
- Первичные иммунные клетки обрабатывали флуоресцентными наночастицами диоксида кремния.
- Клетки маркировали специфическими антителами для анализа методом проточной цитометрии.
- Настройки компенсации корректировали с учетом интерференции наночастиц.
- Для оценки поглощения наночастиц проводили анализ интернализации.
Основные результаты
- Различные популяции иммунных клеток продемонстрировали разную скорость интернализации наночастиц.
- Проточная цитометрия позволила эффективно дифференцировать типы клеток на основе интенсивности флуоресценции.
- Интернализация была подтверждена с помощью дополнительных методов микроскопии.
- Результаты указали на дозозависимую связь при поглощении наночастиц моноцитами.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует эффективность использования проточной цитометрии для анализа взаимодействия наночастиц с иммунными клетками.
- Полученные результаты расширяют понимание того, как наночастицы могут влиять на иммунный ответ.
- Дальнейшие исследования могут быть направлены на изучение терапевтического применения наночастиц в иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет количественно оценить интернализацию наночастиц в субпопуляциях первичных иммунных клеток, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при разработке нанотерапевтических средств. Предоставляя данные о поглощении в зависимости от дозы и типа клеток, этот подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и служит основанием для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки интервенций на основе наночастиц. Описанный метод решает одну из ключевых задач этапа поиска: преобразование взаимодействий между наночастицами и клетками в практически применимые и воспроизводимые показатели для приоритизации портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки захвата наночастиц различными подмножествами иммунных клеток, что дает возможность определить, какие именно популяции клеток взаимодействуют с наноносителями.
- Практическая ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет стандартизированного и воспроизводимого измерения интернализации с помощью анализа интенсивности флуоресценции и сдвига бокового светорассеяния.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля исследований путем выявления типов клеток с высоким или низким сродством к наночастицам, что помогает в выборе мишеней для иммуномодулирующей нанотерапии.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: подготовка валидированных систем иммунных клеток для последующего скрининга путем установления базовых профилей взаимодействия с наночастицами.
- Количественные показатели: получение данных об интенсивности флуоресценции и показателях SSC, что обеспечивает стандартизированные, сопоставимые результаты для различных условий и временных точек.
- Повторное использование платформы: поддержка масштабируемых рабочих процессов скрининга за счет согласованных протоколов гейтирования, компенсации и маркировки антителами, применимых к различным составам наночастиц.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Метод применим к первичной микроглии мышей-мутантов, что позволяет проводить исследования наночастиц, нацеленных на ЦНС, в иммунных моделях соответствующих заболеваний.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты проточной цитометрии с подтверждением методом конфокальной микроскопии, что усиливает механистическую интерпретацию для доклинической валидации.
- Обоснование дальнейших этапов с учетом рисков: Помогает принимать решения о переходе к следующим этапам исследования, выявляя различия в скорости интернализации, например, измененное поглощение наночастиц в GFP-положительных субпопуляциях микроглии.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от раннего скрининга связывания с мишенью до доклинической оценки механизмов действия, что особенно актуально для иммуномодулирующей нанотерапии, где профили взаимодействия с иммунными клетками имеют критическое значение.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез, связывая воздействие наночастиц с измеримыми изменениями гранулярности и флуоресценции клеток, что позволяет прояснить механизмы активации или модуляции иммунных клеток.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных этапов изоляции, маркировки и компенсации, что гарантирует воспроизводимую количественную оценку взаимодействий между наночастицами и клетками.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение зависимых переменных (интенсивность флуоресценции, сдвиги SSC), что позволяет сравнивать интернализацию в различных типах клеток, при разных концентрациях и временных точках.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической валидацией посредством ортогонального подтверждения с помощью конфокальной микроскопии, что соответствует подходу к снижению рисков за счет изучения механизмов, основанных на биомаркерах.
- Повторное использование в организации: Функционирует как универсальный инструмент для различных форматов наночастиц (например, FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) и иммунных моделей (лейкоциты крови человека, микроглия мыши), сокращая затраты на повторную разработку методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, предоставляя количественные данные об интернализации наночастиц с разрешением до отдельной клетки, что повышает уверенность в выборе мишени для иммуномодулирующих стратегий.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет четко определенных протоколов компенсации и панелей антител, сводя к минимуму вариативность между разными пользователями и центрами.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления популяций иммунных клеток, склонных к взаимодействию с наночастицами, что снижает биологические риски на поздних этапах разработки нанотерапевтических препаратов.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков, выделяя составы наночастиц с благоприятными или нежелательными профилями взаимодействия с иммунными клетками.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области компенсации при проточной цитометрии, в частности для устранения помех бокового светорассеяния, вызываемых наночастицами, при коррекции спектрального перекрытия.
- Метод зависит от наличия доступных проточных цитометров с возможностью детектирования флуоресценции и светорассеяния, а также панелей антител для идентификации субпопуляций иммунных клеток.
- Необходима межкомандная стандартизация стратегий гейтирования и настроек компенсации для обеспечения согласованности интерпретации данных между группами фундаментальных и доклинических исследований.
- При применении к различным модельным системам (например, адгезивным и неадгезивным клеткам, первичным клеткам человека и мыши) требуется адаптация метода для сохранения точности анализа.
- Практическое ограничение: свойства флуоресценции или светорассеяния наночастиц могут создавать помехи для некоторых флуорохромов, что требует тщательного подбора панели и валидации компенсации, как указано в протоколе.
