Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении взаимодействий флуоресцентных наночастиц с субпопуляциями первичных иммунных клеток с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем предварительной обработки интересующих клеток наночастицами. На следующем этапе клетки помечаются антителами против специфических для клеток поверхностных маркеров, а затем анализируются с помощью проточной цитометрии.

В конечном счете, взаимодействие наночастиц с отдельными популяциями иммунных клеток может быть измерено. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микроскопия, заключается в том, что с помощью этого метода изменения интенсивности флуоресценции, индуцированные наночастицами, могут быть количественно оценены в неадгезивных клеточных популяциях. В каждую лунку по 12 лунок тарелка.

Затем добавьте по 10 микролитров свежеприготовленной рабочей флуоресцентной суспензии наночастиц диоксида кремния в каждую опытную лунку, добавив в это же время равный объем полной среды в необработанные контрольные лунки. После часовой интернализации при 37 градусах Цельсия перенесите образцы в отдельные 1,5-миллилитровые полипропиленовые пробирки, а затем в течение трех минут уменьшите количество образцов при температуре 6000 G и комнатной температуре, чтобы окрашивать клетки CD 14 с помощью синего цвета. Инкубируйте 100 микролитров каждой клеточной суспензии в 10 микролитрах человеческого антитела в соотношении один к 11 в проточном буфере в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После смывания несвязанного антитела в одном миллилитре проточного буфера ресуспендируют клетки в 200 микролитрах свежего проточного буфера для проточного цитометрического анализа.

Затем, чтобы настроить компенсацию спектрального перелива, откройте окно настроек прибора в программном обеспечении проточной цитометрии, затем получите образец без меченых наночастиц антител на низкой скорости жидкости. Регулировка настроек компенсации в присутствии флуоресцентных наночастиц является самой сложной частью процедуры, поскольку наночастицы могут мешать боковому рассеянию. Затем нарисуйте достаточно большой вентиль вокруг желаемой популяции клеток.

Загрузите еще один непомеченный образец и откройте вкладку компенсации в окне настроек инструмента. Регулируйте коэффициент компенсации во время сбора данных до тех пор, пока интенсивность флуоресценции в канале распространения не станет примерно одинаковой для положительной и отрицательной популяций флуорохрома. Наконец, после корректировки компенсации для каждой окрашенной контрольной пробирки с флуорохромом, чтения образцов, обработанных наночастицами, чтобы лучше охарактеризовать поведение лейкоцитов в ответ на наночастицы, были проведены анализы интернализации, как показано только что продемонстрировано.

Например, в этом репрезентативном эксперименте три основные субпопуляции лейкоцитов крови были четко идентифицированы по прямому и боковому рассеянию после выделения PBMC. Кроме того, после обработки диоксидом кремния лимфоциты, моноциты и гранулоциты демонстрировали различную скорость интернализации наночастиц, на что указывает их интенсивность флуоресценции. На этих изображениях интернализация наночастиц демонстрируется в первичных CD 14 положительных моноцитах, выделенных из pbmc.

Эти диаграммы рассеяния отображают CD14 положительные моноциты в присутствии наночастиц диоксида кремния Фитца. Гистограмма иллюстрирует количественную оценку фитзи-положительных клеток, выраженную в виде интенсивности флуоресценции. Аналогичные эксперименты по интернализации были проведены с моноцитами TP one, обработанными возрастающими концентрациями наночастиц диоксида кремния Фитца с необработанными клетками в качестве негативного контроля.

Точечные графики иллюстрируют дозозависимое увеличение бокового рассеяния при неизменном прямом рассеянии в одной клеточной линии TP после интернализации наночастиц. Данные из этих графиков свидетельствуют о том, что обработка наночастицами диоксида кремния Fitz индуцирует дозозависимую интернализацию в моноцитах, что подчеркивается усилением внутриклеточной зернистости Чтобы получить более глубокое понимание взаимодействий между иммунными клетками и наночастицами, микроглии культивировали в течение семи дней in vitro и инкубировали с наночастицами в течение одного часа. Флуоресцентная микроскопия показала смешанную культуру первичных глиальных клеток с большим количеством GFP-отрицательных неадгезивных астроцитов и некоторыми GFP-положительными клетками.

В этом репрезентативном эксперименте с помощью проточной цитометрии можно было различить три глиальные субпопуляции с одним антителом CD 11 B, окрашивающим CD 11 B, отрицательными GFP-негативными астроцитами и другими глиальными клетками, микроглиальными CD 11 B положительными GFP-отрицательными клетками и CD 11 B положительной GFP-положительной субпопуляцией. Последние две субпопуляции способны интернализировать наночастицы с несколько повышенным дефицитом в GFP-положительной популяции. Интернализация наночастиц может быть дополнительно проверена с помощью конфокальной микроскопии, как показано на этом изображении с использованием наночастиц диоксида кремния палочкового домина.

При попытке пройти эту процедуру важно помнить о хранении образцов в темноте, чтобы избежать обесцвечивания флуоресцентных красителей и сохранять температуру в четыре градуса во время инкубации антител. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как конфокальная микроскопия, чтобы ответить на дополнительный вопрос о внутриклеточной локализации наночастиц.