Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 7:27 мин. • July 8th, 2025
CRISPR интерференция или CRISPRi использует деактивированный вариант Cas9, dCas9, для целенаправленного сайленсинга генов, который подавляет функцию гена.
Для проведения CRISPRi используется челночная векторная конструкция - плазмида, содержащая истоки репликации, соответствующие как бактериям E. coli, так и Leptospira, облегчающие размножение у обоих видов.
Вектор также содержит последовательность, специфичную для гена dCas9, и одноведущую РНК или sgРНК для распознавания последовательности-мишени.
Первоначально челночной вектор присутствует внутри донора E. coli. Дополните донорскую культуру E. coli лептоспирами хозяина для облегчения конъюгации. Конъюгация устанавливает прямой межклеточный контакт между организмами, способствуя поглощению челночных плазмид лептоспирами. Внутри клетки плазмидная конструкция продуцирует последовательности sgRNA и экспрессирует белки dCas9.
sgРНК содержит область протоспейсера, которая распознает ее комплементарную целевую область на ДНК лептоспиры, рядом с мотивом соседнего протоспейсера или PAM - короткой последовательностью узнавания на ДНК хозяина. Это помогает dCas9 образовывать комплекс с sgРНК в целевом участке ниже по течению к сайту начала
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео