CRISPR интерференционный сайленсинг генов: метод целенаправленного подавления функции генов у патогенных лептоспир

CRISPR интерференция или CRISPRi использует деактивированный вариант Cas9, dCas9, для целенаправленного сайленсинга генов, который подавляет функцию гена.

Для проведения CRISPRi используется челночная векторная конструкция - плазмида, содержащая истоки репликации, соответствующие как бактериям E. coli, так и Leptospira, облегчающие размножение у обоих видов.

Вектор также содержит последовательность, специфичную для гена dCas9, и одноведущую РНК или sgРНК для распознавания последовательности-мишени.

Первоначально челночной вектор присутствует внутри донора E. coli. Дополните донорскую культуру E. coli лептоспирами хозяина для облегчения конъюгации. Конъюгация устанавливает прямой межклеточный контакт между организмами, способствуя поглощению челночных плазмид лептоспирами. Внутри клетки плазмидная конструкция продуцирует последовательности sgRNA и экспрессирует белки dCas9.

sgРНК содержит область протоспейсера, которая распознает ее комплементарную целевую область на ДНК лептоспиры, рядом с мотивом соседнего протоспейсера или PAM - короткой последовательностью узнавания на ДНК хозяина. Это помогает dCas9 образовывать комплекс с sgРНК в целевом участке ниже по течению к сайту начала транскрипции гена.

dCas9 из комплекса sgRNA-dCas9 не обладает каталитической активностью для расщепления нитей ДНК, вместо этого он действует как физический барьер для движения фермента мРНК-полимеразы, в конечном итоге ингибируя транскрипцию генов. Используйте генно-молчаливую Leptospira для дальнейшего тестирования.

Для конъюгации клетки лептоспиры выращивают при температуре 29 или 37 градусов Цельсия в среде HAN. За сутки до конъюгации донорские клетки E. coli выращивают в среде LB с добавлением диаминопимеловой кислоты - DAP и спектиномицина.

Затем, в день конъюгации, выращивайте насыщенные культуры E. coli в LB плюс DAP. Внутри колпака для биобезопасности соберите фильтрационный аппарат, поместив мембранный фильтр поверх стеклянного основания, а затем стеклянную воронку объемом 15 мл. Обе детали удерживаются вместе пружинным зажимом. Затем подключите стекло к вакуумному насосу. Добавьте в воронку 5 мл культур лептоспиры.

Затем добавьте штамм E. coli β2163, содержащий интересующую плазмиду. Объем будет варьироваться в зависимости от оптической плотности культуры. Мы стремимся к соотношению ячеек 1:1. Включите вакуумный насос. Теперь жидкости будут проникать через мембрану, а клетки будут концентрироваться на ней.

Возьмите фильтр и поместите его на пластину EMJH и DAP бактериальной стороной вверх. Инкубируйте пластины при температуре 29 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем извлеките фильтры из пластин и поместите их в коническую трубку объемом 50 мл.

Используйте 1 мл жидкого фильтрующего материала HAN для извлечения клеток из фильтра путем пипетирования. Визуализируйте восстановленные клетки с помощью темнопольной микроскопии.

На этой стадии можно увидеть эквивалентное количество E. coli и Leptospires. От 100 до 200 микролитров используются для распространения бактерий на двух планшетах HAN, содержащих спектиномицин. На этой стадии DAP опускается, и кишечная палочка не будет расти. Планшеты инкубируются при температуре 37 градусов Цельсия и 3%_CO2. Колонии должны быть заметны в период от 8 до 10 дней.