Трансформация генов на основе бинарного бактериального искусственного хромосомного вектора у растений арабидопсиса: метод получения трансгенных растений с вкраплением одной копии

Начните с растений арабидопсиса с незрелыми цветочными головками. Окуните цветочные головки в клеточную суспензию агробактерий, несущую Т-ДНК, клонированную бинарной бактериальной искусственной хромосомой или BIBAC, вектором, реплицирующимся как в системах E. coli, так и в системах Agrobacterium. Этот бинарный вектор Т-ДНК может доставлять крупные трансгены, такие как ген устойчивости к гербицидам и флуоресцентные селективные маркеры, вдоль промотора, специфичного для семян.

Пока цветочные головки все еще погружены в воду, осторожно взбалтывайте растения, чтобы усилить их контакт с агробактериями. Обладая присущей ей способностью заражать растения, агробактерия переносит трансген в клетку цветка. Когда трансген попадает в клетку, он перемещается в ядро и сливается с геномом растения.

Теперь оберните растение пищевой пленкой и инкубируйте в темноте, чтобы сохранить влажность для лучшего преобразования. Снимите пленку и выращивайте растения в физиологических условиях, пока они не дадут семена.

Далее соберите семена и понаблюдайте под флуоресцентным микроскопом для выбора трансформаторов. Теперь вырастите преобразованные семена в подходящих условиях до появления всходов. Опрыскайте растения гербицидом, и инкубируйте.

Растения с множественной инсерцией трансгенов испытывают подавление экспрессии и увядание генов, в то время как растения с инсерцией одной копии экспрессируют активный фермент, метаболизирующий гербицид, и выживают после обработки. Извлечь геномную ДНК из выживших трансформантов и провести ПЦР для расчета эффективности вставки одной копии.

Чтобы подготовить растения арабидопсиса к преображению, выращивайте растения арабидопсиса в теплице или камере выращивания с контролируемым климатом до тех пор, пока они не начнут цвести. Обрежьте первые болты, чтобы образовалось больше второстепенных болтов. Растения готовы к погружению через четыре-шесть дней после обрезки, когда у растений много незрелых цветочных головок и мало удобренных силиков.

Чтобы выполнить окунание цветов, окуните соцветия на 5-10 секунд в суспензию агробактерий. Используйте легкое помешивание. Оберните надземные части растений пищевой пленкой, чтобы поддерживать высокую влажность, и накройте горшки с растениями ящиком, чтобы растения оставались в темноте.

Высиживайте растения в течение двух дней в теплице или ростовой камере. Через два дня снимите коробку и пищевую пленку и вырастите растения до зрелости в теплице или камере для выращивания. Для повышения эффективности трансформации те же растения можно повторно окунать через семь дней после первого погружения.

Далее, когда преобразованные растения созреют и высохнут, соберите семена. Объедините и проанализируйте семена растений, преобразованные с помощью той же конструкции, что и один набор. В случае трансформации растений с помощью производного плазмиды BIBAC-RFP-Gateway, идентифицируйте трансгенные растения путем анализа семян с помощью флуоресцентной микроскопии.

Чтобы обнаружить экспрессию DsRed в семенных оболочках, визуализируйте семена с возбуждением 560 нанометров и излучением от 600 до 650 нанометров. Отделите флуоресцентные семена от нефлуоресцентных аналогов с помощью щипцов.

Для скрининга трансгенных растений, трансформированных производным плазмиды BIBAC-BAR-Gateway, высевают семена в лотки, заполненные почвой. Обеспечьте равномерное распределение семян по лоткам, суспензив семена в 0,1% агаре в среде 0,5X MS, и распределите семена с помощью пипетки объемом 1 миллилитров.

Стимулируйте прорастание семян синхронным образом, инкубируя семена не менее двух дней при температуре 4 градуса Цельсия. Это можно сделать до или после посева семян. Через две-три недели после посева семян опрыскайте рассаду 0,5%-ным раствором Глюфосината-аммония. Используйте 500 миллилитров раствора Глюфосината-аммония на 1 квадратный метр. Пересадите выжившую рассаду в горшки. Проанализируйте растения, устойчивые к глюфосинат-аммонию, с помощью ПЦР на наличие интересующего конструкта.