Сайт-специфическая бактериальная хромосома Инженерно: ΦC31 интегразы опосредованная кассеты бирже (IMCE)

Общая цель следующего эксперимента заключается в интеграции желаемой конструкции ДНК в бактериальную хромосому в заранее определенном локусе. Это достигается с помощью протокола конъюгации с использованием четырех модифицированных бактериальных штаммов. Штамм-реципиент имеет интегрированную в хромосому последовательность «посадочной площадки» (landing pad), состоящую из гена устойчивости к специмицину и гена бета-глюкуронидазы e coli, фланкированных сайтами ATP.

Донорский штамм P JH one 10 несет плазмиду, содержащую B-сайты, фланкирующие ген-заглушку красного флуоресцентного белка, и ген устойчивости к антибиотику. Донорский штамм PJC two несет плазмиду, содержащую сайт-специфичную интегразу фага C 31 streptomyces под контролем промотора LAC. Четвертый штамм MT 616 обеспечивает экспрессию генов переноса, необходимых для конъюгации — передачи плазмид от клетки к клетке, что приводит к созданию трансгенных реципиентных штаммов.

Получение двух плазмид, необходимых для обмена кассет, опосредованного интегразой. Обмен донорской кассеты из плазмиды PJ H one 10 с маркерами кассеты «посадочной площадки» (landing pad) в хромосоме приводит к потере маркеров посадочной площадки SPR и UIDA и сохранению донорской кассеты RFP и GMR в полученном трансмигранте. Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими способами, такими как гомологичная рекомбинация, является простота и эффективность протокола.

Данный метод также применим к широкому спектру бактерий. В качестве акцепторного штамма в данном видео используется штамм S. milli latte. За два дня до процедуры спаривания для создания транс-интегринов пересейте одну колонию в 5 мл среды TY со спектномицином. Инкубируйте штамм S. milli при 30 °C в течение двух дней с перемешиванием. За день до процедуры спаривания пересейте следующие штаммы E. coli в 5 мл жидкой среды LB с добавлением соответствующего антибиотика: DH5α, содержащий плазмиду экспрессии интегразы, в среду с тетрациклином; MT616 (мобилизатор) — в среду с хлорамфениколом; и DH5α, содержащий плазмиду донорной кассеты, в среду с гентамицином. Инкубируйте три штамма E. coli в течение ночи при 37 °C при постоянном перемешивании. Для подготовки клеток к процедуре спаривания перенесите по 1,5 мл каждой из четырех культур в пробирку и центрифугируйте при 17 000 ×g в течение 30 секунд для осаждения клеток. Удалите среду и ресуспендируйте каждый клеточный осадок в 1 мл стерильного 0,85% раствора NaCl. Снова центрифугируйте пробирки, удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в 100 µL стерильного 0,85% раствора NaCl. С помощью пипетки нанесите по 10 µL промытой культуры каждого штамма отдельными пятнами на чашку с обычным TY-агаром.

Эти пятна являются контрольными. Далее добавьте по 40 µL каждого штамма, за исключением e coli DH5α, содержащего Pjc2, в стерильную пробирку и перемешайте путем пипетирования вверх-вниз; нанесите 120 µL этой смеси на чашку с обычным TY-агаром. Это пятно служит отрицательным контролем без интегразы.

Наконец, добавьте по 40 µL каждого из четырех штаммов в стерильную пробирку, перемешайте и нанесите 160 µL этой смеси на ту же чашку с агаром TDY. Эта точка является точкой спаривания для обмена кассет, опосредованного интегразой.

Поместите планшет в ламинарный шкаф и дайте пятнам высохнуть в течение примерно 20 минут. После этого герметично закройте планшет и инкубируйте при 30 °C в течение ночи, следующей за днем проведения протокола спаривания и высева. Перенесите два контрольных пятна и пятно спаривания IMCE на чашки с агаром TY, дополненным стрептомицином и гентамицином.

Штамм-акцептор S milli несет мутацию, обеспечивающую высокий уровень устойчивости к стрептомицину, что необходимо для расчета эффективности IMCE. Ресуспендируйте примерно одну четверть пятна спаривания IMCE в 500 µL стерильного 0,85% раствора Sodium chloride; приготовьте десятикратные серийные разведения до 10⁻⁷. Высейте разведения от 10⁻² до 10⁻⁵ на чашки с TY агаром, дополненным стрептомицином, гентамицином и xgl, для селекции трансмигрантов. Высейте разведения от 10⁻³ до 10⁻⁷ на чашки с TY агаром, дополненным стрептомицином и xgl, для селекции как трансмигрантов, так и потенциальных реципиентов. IE общее количество реципиентов; инкубируйте чашки при 30 °C в течение трех дней.

Рассматривайте трансдуцированные клетки RFP при зеленом свете и через красный фильтр; вычислите процент эффективности IMCE как отношение КОЕ транс-иммигрантов к КОЕ всех реципиентов. Примерно половина трансдуцированных клеток подвергнется истинному обмену, в результате чего через три дня инкубации на среде Ty, дополненной стрептомицином и гентамицином, они станут белыми и нечувствительными. В следующих контрольных штаммах рост должен отсутствовать: контроль без интегразы s milli latte UW 2 27, контроль e coli MT 616, контроль e coli DH five alpha, содержащий P JH one 10, и контроль e coli DH five alpha, содержащий PJC two. Напротив, посев IMCE из места спаривания должен показать сливной рост на основном штрихе и множество колоний на втором штрихе. Следующие два изображения демонстрируют ресуспензии разведения 10⁻² места спаривания на агаре TY streptomycin xgl и на агаре TY streptomycin Gentamycin xgl.

Синие колонии представляют собой одиночные рекомбинанты. В то время как белые колонии являются транс-интегринами, претерпевшими истинный обмен кассет; при просмотре под зеленым светом через красный фильтр суспензия ресуспендирования для споттинга спаривания в разведении 10⁻² на агаре TY со стрептомицином, цинамоном и Xgl не проявляет флуоресценции. Напротив, суспензия ресуспендирования для споттинга спаривания в разведении 10⁻² на агаре Ty со стрептомицином, гентамицином и Xgl демонстрирует два уровня флуоресценции.

Более яркие колонии соответствуют синим колониям и обладают более высокой экспрессией RFP, что, вероятно, обусловлено сквозным считыванием с промотора LAC в векторе. Менее яркие колонии соответствуют белым колониям, в которых произошел истинный обмен кассет; они содержат RFP только с его непосредственным промотором без сквозного считывания с промотора LAC. Эти группы также должны быть чувствительны к спектиномицину.

Эффективность транс-интеграции, выраженная как процент транс-иммигрантов от общего числа реципиентов, должна находиться в диапазоне 0,5%.После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать бактериальную конъюгацию с помощью наших сконструированных штаммов для вставки ДНК-конструкций в бактериальную хромосому.