Сайт-специфическая бактериальная хромосома Инженерно: ΦC31 интегразы опосредованная кассеты бирже (IMCE)

Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы интегрировать желаемую конструкцию ДНК в бактериальную хромосому в заранее определенном локусе. Это достигается за счет протокола спаривания с участием четырех сконструированных бактериальных штаммов. Штамм-реципиент имеет последовательность посадочной площадки, состоящую из гена устойчивости к мицину и гена бета-глюкуронидазы кишечной палочки, окруженного сайтами АТФ, интегрированными в его хромосому.

Донорский штамм P JH one 10 несет плазмиду, содержащую в В-сайтах фланкирующий ген красного флуоресцентного белка и ген устойчивости к антибиотикам. Два донорских штамма PJC несут плазмиду, содержащую сайт-специфическую интегразу из фага С 31 стрептомицетов под контролем промотора LAC. Четвертый штамм MT 616 обеспечивает трансфер генов, необходимых для конъюгации, перенос плазмид из клетки в клетку, в результате чего происходит создание транс через реципиент штаммов.

Получение двух плазмид, необходимых для обмена кассетами, опосредованными интегразой. Обмен донорской кассеты из плазмиды PJ H one 10 с маркерами кассеты посадочной площадки на хромосоме приводит к потере маркеров посадочной площадки, SPR и UIDA, а также к сохранению донорской кассеты RFP и GMR у последующего транс-иммигранта. Основным преимуществом этой методики перед другими методами, такими как гомологичная рекомбинация, является простота и эффективность протокола.

Он также может передаваться различным бактериям. Акцепторный штамм, используемый в этом видео, представляет собой штамм S milli latte за два дня до процедуры спаривания для создания трансинтегринов инокулировать из одной колонии в пять миллилитров среды TY с помощью мицина spect инкубировать штамм S milli при 30 градусах Цельсия в течение двух дней с встряхиванием за день до процедуры спаривания. инокулировать каждый из следующих штаммов кишечной палочки в пять миллилитров жидкой среды LB с добавлением с помощью соответствующего антибиотика DH пять альфа, содержащих плазмиду экспрессии интегразы, в среду с тетрациклином MT 616, мобилизатор промежуточный с хлорамфениколом и DH пять альфа, содержащий донорскую кассетную плазмиду, в среду с гентамицином, инкубируют три штамма e Coli в течение ночи при 37 градусах Цельсия с постоянным встряхиванием для подготовки клеток к процедуре спаривания. Переложите по 1,5 миллилитров каждой из четырех культур в пробирку и центрифугируйте при 17 000 умноженных на G в течение 30 секунд для сбора клеточной гранулы, выбросьте среду и повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в одном миллилитре стерильного 0,85% хлорида натрия снова центрифугируйте пробирки после выброса надосадочной жидкости Резус суспендируйте каждую гранулу в 100 микролитрах стерильного 0,85% хлорида натрия с помощью пипетки индивидуально нанесите по 10 микролитров промытой культуры на каждую процедите на простую пластину с агаром TY.

Эти точки являются контрольными точками. Далее добавьте по 40 микролитров каждого штамма, исключая кишечную палочку DH пять альфа-содержащих Pjc два в стерильную пробирку и перемешайте пипетированием вверх и вниз 120 микролитров этой смеси на обычной агаровой пластине TY. Это место является отрицательным контролем без интегразы.

Наконец, добавьте по 40 микролитров каждого из четырех штаммов в стерильную пробирку, смешайте и нанесите 160 микролитров этой смеси на ту же агаровую пластину TDY. Это место является опосредованным интегразой местом сопряжения кассетного обмена.

Поместите пластину в колпак с ламинарным потоком и дайте пятнам высохнуть в течение примерно 20 минут после этого. Запечатайте пластину и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи на следующий день после серии протокола спаривания. Две контрольные точки и точка сопряжения IMCE с агаровыми пластинами TY с добавлением стрептомицина и гентамицина.

Штамм акцептора S milli несет мутацию, придающую высокий уровень устойчивости к стрептомицину для расчета эффективности IMCE Резус суспендировать примерно одну четверть места сопряжения IMCE в 500 мкл стерильных 0,85%Хлорид натрия делают десятикратные серийные разведения до 10 к отрицательной седьмой пластине Разведения имеют тенденцию к отрицательным двум через 10 к отрицательным пяти на агаровых пластинах TY с добавлением стрептомицина, gentamycin и xgl для отбора транс-иммигрантов. Разведения в планшетах имеют тенденцию к отрицательным значениям от трех до 10 до отрицательных семи на агаровых пластинах TY, дополненных стрептомицином и xgl, для отбора как транс-иммигрантов, так и потенциальных реципиентов. Реципиенты ИЭ инкубируют планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней.

Просмотрите RFP trans под зеленым светом и с помощью красного фильтра рассчитайте процент эффективности IMCE как КОЕ транс-иммигрантов по сравнению с КОЕ общего числа получателей, примерно половина транс подвергнется истинному обмену, что сделает их белыми и нечувствительными после трех дней инкубации на Ty с добавлением стрептомицина и гентамицина, не должно быть роста следующих контрольных штаммов, no integrase control s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH five alpha containing P JH one 10 control и e coli DH five alpha containing PJC two control. Напротив, полоса IMCE от места спаривания должна иметь сливающийся рост на полосе головы и много колоний на второй полосе. На следующих двух изображениях показаны ресуспензии 10 к отрицательным двум разведению пятна спаривания на стрептомицине TY xgl агаре и на стрептомицине TY Gentamycin xgl агаре на стрептомицине TY Gentamycin xgl агаре.

Синие колонии являются одиночными рекомбинантами. В то время как белые колонии представляют собой трансинтегрины, которые подверглись истинному кассетному обмену при просмотре под зеленым светом и через красный фильтр, тенденцию к отрицательному двум разведению суспензии ресусзии спаричных пятен на агаре TY strept cin xgl не хватает флуоресценции. Напротив, разведение суспензии ресуспензии спаричного пятна на стрептомицине Ty гентамицина Xgl Агара в соотношении от 10 до минус 2 демонстрирует два уровня флуоресценции.

Более яркие колонии соответствуют синим колониям и имеют более высокую экспрессию RFP, предположительно из-за стимулирования чтения от промотора LAC в векторе. Менее яркие колонии соответствуют белым колониям, которые подверглись истинному кассетному обмену и содержат RFP только с его непосредственным промотором и без считывания с промотора LAC. Эти тенденции иммигранты также должны быть чувствительны к крупицам мицина.

Эффективность транс-интеграции, выраженная в процентном соотношении транс-иммигрантов к общему числу реципиентов, должна быть в пределах 0,5%После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать бактериальную конъюгацию с использованием наших сконструированных штаммов для встраивания конструкций ДНК в бактериальную хромосому.