Зеленый флуоресцирующий белок Сплит система для визуализации эффекторов доставлены из бактерий во время инфекции

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия растений и микробов, например, как патогенные бактерии могут нарушить оптимальное состояние своих растительных клеток-хозяев с помощью белков, называемых эффекторами, секретируемых в растительных клетках. Основное преимущество этой методики заключается в том, что бактериальный эффекторный белок экспрессируется в бактериальной клетке с помощью их нативной системы экспрессии, а затем доставляется в растительную клетку через бактериальную систему секреции III типа. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте растения Nicotiana benthamiana и Arabidopsis thaliana в соответствии с текстовым протоколом.

Затем используйте стандартную электропорацию для преобразования плазмидного носителя и эффекторного гена, слитого с меткой sfGFP11, в штамм томата Pseudomonas syringae pathovar CUCPB5500. Оптимальный временной момент и уровень экспрессии, или восстановленный sfGFP, на самом деле зависят от вашего эффекторного белка. Мы рекомендуем оптимизировать условия прививки или наблюдения.

Аккуратно распределите трансформированные бактериальные клетки по поверхности пластин King's B Agar. Затем инкубируйте пластины при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух суток. После этого инокулируйте одну бактериальную колонию в жидкую среду King's B антибиотиком, подходящим для переносчика.

Инкубировать в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. На следующий день добавьте автоклавный глицерин в инокулированную среду до конечной концентрации 50% Хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для начала превратите плазмиду в клетки GV3101 штамма Agrobacterium tumefaciens, как указано в текстовом протоколе.

Выращивайте клетки на добавленной среде LB Agar при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух дней. Используя одну колонию из среды LB Agar, введите 5 миллилитров добавленной жидкой среды LB. Затем выращивайте клетки в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту.

После этого центрифугируйте при 3000 G в течение 10 минут, чтобы собрать клетки. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр свежеприготовленного инфильтрационного буфера. С помощью спектрофотометра определите количество клеток агробактерий, измерив значение оптической плотности при поглощении 600 нанометров.

Затем используйте инфильтрационный буфер, чтобы отрегулировать внешний диаметр 600 бактериальных клеток до 0,5. Оставьте культуру на мягкой качалке при комнатной температуре на один-пять часов. Чтобы проникнуть в листья, используйте кончик пипетки объемом 10 микролитров, чтобы проткнуть отверстие в центре каждого листа.

С помощью безыгольного шприца объемом 1 миллилитр осторожно введите 500 микролитров суспензии Agrobacterium в адаксиальную сторону листа. Сотрите остатки бактериальной суспензии с листьев и отметьте границу инфильтрированного участка. Держите зараженные растения в камере роста при температуре 25 градусов Цельсия и влажности 60% в течение двух дней.

Переведите преобразованный штамм Pseudomonas из глицеринового запаса в среду King's B Agar с соответствующим антибиотиком. Выдерживать при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух суток. Инокулируйте петлю клеток Pseudomonas в жидкую среду с глутаматом маннита.

Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин. После этого центрифугируйте при 3000 G в течение 10 минут, чтобы собрать клетки. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10-миллимолярном растворе хлорида магния.

Затем отрегулируйте оптическую плотность на 0,02 для листьев Nicotiana benthamiana и на 0,002 для листьев Arabidopsis. Для листьев Nicotiana benthamiana инфильтрируйте суспензию Pseudomonas в ту же область, где агробактерия была инфильтрирована двумя днями ранее. Для трансгенного Arabidopsis инфильтрируйте суспензию Pseudomonas в два четырехнедельных коротких листьев, выращенных в течение дня.

Наконец, вырежьте листовой диск для листьев, привитых Pseudomonas. В определенные моменты времени после проникновения Pseudomonas используйте систему конфокального лазерного сканирования для получения изображений двух-двух квадратных сантиметровых листовых дисков одного растения. Наблюдайте за клетками вдали от инфильтрационного отверстия, чтобы избежать гибели мертвых клеток от ран.

Транслоцированные эффекторы из бактерий присутствуют только в очень малых количествах. Таким образом, вы можете увеличить мощность лазера и получить флуоресцентное излучение для обнаружения флуоресцентного сигнала. Тем не менее, не переусердствуйте, чтобы избежать захвата ложного сигнала от автофлуоресценции от растительных клеток.

В этом исследовании используется подход на основе флуоресцентных белков для мониторинга эффекторов, секретируемых бактериями в клетках хозяина. Здесь показано конфокальное лазерное сканирование листьев Nicotiana benthamiana через три часа после заражения. Клетки, экспрессирующие оптимизированный sfGFP только с AvrB, не проявляют флуоресцентного сигнала.

Тем не менее, сигналы GFP видны от инфицированных клеток, содержащих AvrB, sfGFP11. Это подтверждает, что комплекс AvrB sfGFP11 восстанавливается с оптимизированным sfGFP в цитозоле, а затем транслоцируется в плазматическую мембрану. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что растительные материалы должны оставаться здоровыми и готовить свежую культуру бактерий для активных клеток.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как анализ крови на смолу, чтобы понять ложную трансляционную модификацию эффекторных белков бактерий в растительных клетках во время иммунных реакций растений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать доставку эффектора III типа в инфицированные клетки растений. Растительные материалы и бактериальные культуры следует утилизировать в соответствии с критериями вашей лаборатории в отношении биологически опасных отходов и не забывайте носить СИЗ.