Экс естественных изображений Т-клеток у мышей фрагменты лимфатических узлов с Широкоугольные и конфокальной Микроскопы

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации флуоресцентных Т-клеток в срезах лимфатических узлов с помощью широкопольной и конфокальной микроскопии. Это достигается сначала путем удаления мышиного лимфатического узла и встраивания его в аэродинамику с низкой температурой плавления. Затем узел разрезается на участки толщиной 320 микрон с помощью вибрато.

Затем флуоресцентно окрашенные Т-клетки наносятся на срез лимфатического узла. Наконец, Т-клетки, проникшие в срез, визуализируются с помощью широкопольной и конфокальной микроскопии. В конечном итоге можно получить неподвижные и видеографические изображения, которые показывают, как Т-клетки рекрутируются в лимфатический узел и какое подвижное поведение они проявляют в лимфатической ткани. Хорошо.

Основное преимущество таких методик использования существующего металла, как двух фотомикроскопических и интактных органов, заключается в том, что здесь Т-клетки можно визуализировать в трехмерной системе с помощью обычного белопольного микроскопа. Более того, небольшие приготовления, разрешения и доступ к тканевым тканям начинаются с подготовки к 4% низкой температуре плавления. Возникший раствор путем разведения возникшего в PBS и разогревания полученной примеси в микроволновой печи после того, как возникшая полностью растворится.

Поддерживайте температуру раствора при температуре 37 градусов Цельсия до использования. Далее наполните пластиковую тарелку РПМИ. Укомплектуйте питательную среду и поместите в чашку шайбы из нержавеющей стали с внутренним диаметром четыре миллиметра.

Наполните еще одну посуду ледяным PBS, затем добавьте примерно 1,1 миллилитр RPMI. Полная питательная среда на лунку в шестилуночном планшете для культивирования тканей. Вставьте органотипический фильтр в каждую лунку из шести луночных планшетов и установите пластину с температурой четыре градуса Цельсия.

Аккуратно удалите периферические лимфатические узлы из окружающих их тканей у усыпленной мыши. Тщательно рассекайте лимфатические узлы, так как они очень мягкие. Очень важно удалить весь жир из тканей, потому что он очень токсичен для клеток.

Поместите лимфатические узлы в пластиковую чашку с ледяным углем PBS. Теперь налейте гель 4%aro в 35-миллиметровую пластиковую посуду и аккуратно перенесите узлы в гель. Затем положите аро на лед на пять минут, чтобы он застыл после того, как он затвердеет, снимите блок с чашки и обрежьте агар, оставив примерно три-пять миллиметров геля вокруг каждого лимфатического узла.

Затем с помощью нетоксичного клея прикрепите встроенные узлы к диску образца виома. Установите диск для образцов в съемный лоток viome и заполните лоток ледяным PBS. Установите скорость вибрации на медленном диапазоне и частоту вибрации на среднем участке встроенной ткани агара толщиной 320 микрон.

Выбросьте первый срез, так как он содержит только поверхностную ткань, а затем с помощью тонких щипцов осторожно перенесите срезы лимфатических узлов по мере их разрезания на вкладыши органотипических культур. Размещайте шайбы из нержавеющей стали на каждом отдельном срезе, следя за тем, чтобы шайбы находились на агро, не покрывая ткань лимфатических узлов. Затем инкубируйте культуральную пластину со срезами лимфатических узлов при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, увлажненном углекислым газом с 5%.

При подготовке Т-клеток к этому этапу используют ночную культуру IL с семью дополненными Т-клетками, которые были выделены путем отбора CD из четырех положительных шариков с использованием максимальной очистки MIL 10, как показано в ранее опубликованной статье JoVE Мэтью и Каллагана. Стирайте TCELL в HBSS в течение пяти минут при 300-кратной силе тяжести при 20 градусах Цельсия. Повторно суспендируйте их в свежем HBSS из расчета 10 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр.

Затем добавьте один микромолярный клеточный трекер зеленого C-M-F-D-A в пробирку с HBSS и соедините этот раствор с клеточным раствором до конечной концентрации красителя 0,5. Микромолярная инкубация клеточной суспензии в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Затем, после двукратной промывки клеток полной средой RPMI в течение пяти минут при 300 G и 20 градусах Цельсия, Риз изгибает меченые Т-клетки в конечной концентрации 10 раз по 10 до шести клеток на миллилитр.

В свежей RPMI, полной питательной среде, извлеките срезы лимфатических узлов из инкубатора. Удалите излишки среды, содержащейся в центре шайбы, с помощью пипетки, не касаясь ткани. Кончиком пипетки аккуратно нанесите от 10 до 20 микролитров меченых Т-клеток в центр шайбы.

Следите за тем, чтобы капля клеточной суспензии оставалась на месте. Инкубируйте срезы и Т-клетки в течение не менее 30 минут, чтобы позволить лимфоцитам мигрировать в ткани. Чтобы начать визуализацию, установите камеру контроля температуры на микроскопе на 37 градусов Цельсия.

Заполните систему слияния для обеспечения непрерывной перфузии среза лимфатического узла кислородосодержащей феноловой красной средой RPMI и в это же время согрейте небольшую пластиковую чашку с кислородонасыщенной RPMI. В показанной здесь системе перфузионная среда поступает в камеру визуализации с одной стороны под действием силы тяжести. Среда отсасывается с помощью насоса, подключенного к сборщику отходов.

Колба извлекает инфильтрированные Т-клетками срезы лимфатических узлов из инкубатора с помощью тонких щипцов. Деликатно. Удалите срез лимфатического узла из шестилуночной пластины. Опустите срез в подогретую насыщенную кислородом среду RPMI на несколько секунд, чтобы смыть все флуоресцентные клетки, которые не проникли в ткань.

Затем положите свежевымытый ломтик вверх дном на камеру визуализации. Нейлоновые нити приподнимают срез от стекла и позволяют насыщенному кислородом раствору диффундировать в ткани. Это необходимо, так как миграция Т-клеток в лимфатических узлах сильно зависит от кислорода.

Затем закрепите ломтик, поместив на него шайбу из нержавеющей стали, чтобы захватить большое поле зрения. Собирайте изображения с помощью линзы объектива, в 10 раз превышающей сухую. Переложите только что вымытый срез лимфатического узла лицевой стороной вверх в пластиковую посуду.

Поставьте на препарат шайбу, чтобы обездвижить его. Теперь фрагменты готовы к созданию образа. Установите препарат на столик вертикального конфокального микроскопа и сфокусируйтесь с помощью объектива с 20-кратным увеличением.

Затем запустите сеанс визуализации и начните сбор данных. К-М-Ф-Д-А. Помеченные зеленым цветом Т-клетки добавлялись к срезу лимфатического узла за 30 минут до получения изображения, как показано на рисунке. Изображение представляет собой максимальную проекцию из пяти изображений, охватывающих 50 микрон в направлении Z, полученных с помощью широкопольного микроскопа.

Эту же цифру можно увидеть в виде яркого поля на этом видео. Зеленые флуоресцентные Т-клетки, которые проникли в срез лимфатического узла, получают изображение с помощью широкопольного микроскопа в течение девяти минут. Анимация представляет собой проекцию Z 50 микрон.

Обратите внимание на активную миграцию Т-клеток внутри среза. Траектории отдельных Т-клеток из одного и того же поля микроскопа отображаются здесь в виде цветовых шлейфов, представляющих их возрастающее смещение от синих низкоподвижных клеток к красным высокоподвижным клеткам. Следы были рассчитаны с помощью Марса.

Белой линией обозначен край узла, а пунктирными овалами обозначены предполагаемые зоны В-клеток. Здесь Т-клетки, добавленные к срезу лимфатического узла, визуализировались в течение 10 минут с помощью конфокального микроскопа. Анимация представляет собой проекцию Z 50 микрон.

Да, эту методику можно адаптировать и к другим типам тканей. И что интересно, срез как а является единственным способом исследовать механизмы, лежащие в основе миграции и локализации Т-клеток в опухолях человека. Например.