Анализ штрих-кодирования для фенотипической и функциональной характеристики иммунных клеток

Начните с тестовых образцов, содержащих стимулированные и фиксированные иммунные клетки.

Стимуляция индуцирует экспрессию специфических маркеров в клетках, в то время как фиксация сохраняет фенотипические маркеры, включая антигены клеточной поверхности, и маркеры функционального состояния, включая цитокины.

Добавьте в каждый образец уникальную комбинацию антител, конъюгированных с изотопами тяжелых металлов.

Этот метод позволяет уникальным образом штрихкодировать несколько образцов, различая каждый образец по комбинации изотопов тяжелых металлов.

Антитела связываются с общим эпитопом, штрих-кодируя все клетки в образцах.

Объедините все образцы со штрихкодами в одной пробирке для последующей обработки.

Добавьте коктейль из конъюгированных с металлом антител к окрашиванию поверхностных антигенов.

Добавьте буфер для пермеабилизации для повышения проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного окрашивания.

Добавьте еще один набор металлоконъюгированных антител для окрашивания внутриклеточных цитокинов.

Штрихкодирование позволяет одновременно окрашивать и получать объединенные образцы с помощью массовой цитометрии. Этот метод максимизирует эффективность анализа, улучшая оценку маркеров фенотипического и функционального состояния.

Чтобы штрих-кодировать лизированные неподвижные клетки, медленно разморозьте образцы из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия на льду. Разбавьте 10-кратный буфер для перманентной завивки штрих-кодированием PBS в соотношении от 1 до 10 и сделайте буфер достаточным для 3 миллилитров на образец.

Наполните одну нестерильную кормушку CSM и одну буфер для завивки с штрих-кодированием 1x. Затем добавьте 1 миллилитр ледяного CSM к только что размороженным образцам. Тщательно перемешайте и переложите в соответствующие предварительно маркированные полипропиленовые кластерные пробирки.

Теперь возьмите образец объемом 10 микролитров и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток. Нормализуйте количество клеток в каждой кластерной пробирке, удалив объем избыточных клеток. Затем центрифугируйте ячейки при 600 умноженных на g в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в 1 миллилитр 1x штрих-кодирования буфера для химической завивки с помощью многоканальной пипетки и центрифугируйте при 600-кратном g в течение 5 минут при комнатной температуре. После этого отсасывайте надосадочную жидкость.

Выровняйте кластерные пробирки на штативе в том же порядке, который указан на ключе штрих-кода, чтобы образец соответствовал его штрих-коду. Добавьте 800 микролитров буфера для химической завивки с штрих-кодированием 1x с помощью многоканальной пипетки во все образцы в кластерных пробирках, не касаясь клеточной гранулы, чтобы уменьшить потерю клеток.

Затем отложите в сторону штатив с кластерными пробирками. Снимите трубки 20-плексного набора палладиевого штрих-кодирования с трубки от температуры минус 20 градусов Цельсия и разморозьте при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров буфера для химической завивки 1x штрих-кодирования, тщательно перемешайте и перенесите 120 микролитров ресуспендированной смеси штрих-кодов в соответствующие образцы клеток в кластерных пробирках.

Тщательно перемешивайте с помощью многоканальной пипетки, чтобы не было перекрестного загрязнения между образцами со штрихкодами по отдельности. Инкубируйте кластерные пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы штрих-коды могли маркировать клетки. Через 30 минут центрифугируйте образцы при 600-кратном g в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте их в 1 миллилитре CSM. Затем центрифугирование и повторная суспендия в CSM.

После этого центрифугируйте при 600-кратном перегрузке g в течение 5 минут при комнатной температуре и аспирируйте надосадочную жидкость. С помощью одной пипетки и с помощью одного и того же наконечника перенесите все клеточные гранулы и около 70-80 микролитров остаточного объема в одну полистирольную пробирку. Не выталкивайте наконечник пипетки. Отложите в сторону одну пипетку с этим наконечником.

С помощью многоканальной пипетки и новых наконечников добавьте 100 микролитров CSM в каждую исходную кластерную пробирку, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток. С помощью одной пипетки с отведенным в сторону наконечником перенесите все клеточные гранулы в 100 микролитров остаточного объема в ту же полистирольную пробирку. Добавьте CSM, чтобы долить полистирольную трубку примерно до 3 миллилитров. Подсчитайте и запишите номер ячейки объединенного набора штрихкодов. Затем центрифугируйте при 600-кратном g в течение 5 минут при комнатной температуре и аспирируйте надосадочную жидкость. Приступайте к окрашиванию образцов со штрих-кодом в тот же день.