Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

Этот метод может помочь ответить на вопросы в области аутоиммунных заболеваний, такие как выявление аномалий клеточной частоты и функциональных различий, таких как производство ключевых цитокинов в условиях аутоиммунного заболевания. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может охватить широкий репертуар или различные типы клеток и функциональные различия из легко доступного образца периферической крови. Как правило, люди, плохо знакомые с этим процессом, могут испытывать трудности с правильным выбором времени для этапов обработки крови, дизайном панели антител, самим процессом штрихкодирования и анализом данных об отдельных клетках больших размеров.

Этот подход системной иммунологии особенно подходит для аутоиммунных заболеваний, таких как СКВ, когда иммунная дисрегуляция широко распространена и проявляется в периферической крови. Визуальная демонстрация этого метода важна для уточнения сроков выполнения этапов, а также для демонстрации того, как несколько образцов могут быть штрих-кодированы и объединены перед анализом масс-цитометрии. Чтобы начать эту процедуру, поместите на стойку пробирки из полистирола с круглым дном пяти различных условий для обработки цельной крови.

Далее добавьте в каждую трубку по одному миллилитру 37 градусов Цельсия RPMI. Затем добавьте по одному миллилитру цельной крови в каждую пробирку и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать с RPMI. Впоследствии добавьте 10 микролитров предварительно разведенного руксолитиниба в пробирку с маркировкой T six plus five R и тщательно перемешайте.

Поместите штатив с пробирками в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и начните засекать время инкубации. Для обработки образца с нулевым содержанием T необходимо дозировать все содержимое пробирки с нулевым содержанием T в коническую пробирку с меткой, содержащую 20 миллилитров буфера lyse/fix с температурой 37 градусов Цельсия при рабочей концентрации. Чтобы оптимизировать восстановление клеток, промойте пробирку буфером lyse/fix и перемешайте, перевернув коническую трубку.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы обеспечить лизис и фиксацию. Затем центрифугируйте ячейки при 500-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре ледяного PBS, чтобы разбить гранулу.

Затем заполните коническую трубку до объема 15 миллилитров PBS. Затем центрифугируйте ячейки при 500-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре CSM, чтобы разбить гранулу.

Затем перенесите образец в меченую микроцентрифужную пробирку для окрашивания антителами. С помощью автоматизированного счетчика клеток подсчитайте клетки с образцом объемом 10 микролитров. Затем центрифугируйте ячейки при 500-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре.

После этого аспирируйте надосадочную жидкость, оставив гранулу примерно в 60 микролитрах остатка. Держите эту гранулу на льду до тех пор, пока образцы из других условий не закончат обработку. При T равном 30 минутам перенесите штатив для пробирок в колпак для культуры тканей.

Добавьте 10 микролитров R848 из расчета 0,1 грамма на микролитр в тюбик T six plus R848 и тщательно перемешайте. Затем добавьте 10 микролитров ЛПС в концентрации 0,01 микрограмма на микролитр в пробирку T six plus LPS и тщательно перемешайте. После этого добавьте четыре микролитра ингибитора переноса белка в пробирки с маркировкой T six, T six plus five, R и T six plus LPS и верните образцы в инкубатор до тех пор, пока T не станет равным шести часам.

Тщательно перемешивайте образцы с помощью пипетки P1000 каждые два часа. При T равном двум часам добавьте четыре микролитра коктейля ингибитора транспорта белка в пробирку T six plus R848. Смешайте все образцы и верните штатив в инкубатор до тех пор, пока T не будет равно шести часам.

При значении T равно четырем часам перемешайте образцы с помощью пипетки P1000 еще раз. При T равняется шести часам, T шесть плюс LPS, T шесть плюс R848 и T шесть плюс пять пробирок с пробирками с пробирками R, как описано для нулевого образца T. Затем храните гранулы в остаточном объеме CSM при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующей обработки.

Чтобы штрих-кодировать лизированные, неподвижные клетки, медленно разморозьте образцы из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия на льду. Разбавьте 10-кратный буфер для перманентной завивки штрих-кодированием PBS в соотношении 1:10 и сделайте буфер достаточным для трех миллилитров на образец. Заполните одну нестерильную кормушку CSM и одну буфер для химической завивки с штрих-кодированием X.

Затем добавьте один миллилитр ледяного CSM к только что размороженным образцам, тщательно перемешайте и переложите в соответствующие предварительно маркированные полипропиленовые кластерные пробирки. Теперь возьмите образец объемом 10 микролитров и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток. Нормализуйте количество клеток в каждой кластерной пробирке, удалив объем избыточных клеток.

Затем центрифугируйте ячейки при температуре 600 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре одного буфера для химической завивки с помощью многоканальной пипетки и центрифугируйте при температуре 600 G в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого отсасывайте надосадочную жидкость.

Выровняйте кластерные пробирки на штативе в том же порядке, который указан на ключе штрих-кода, чтобы образец совпадал со своим штрих-кодом. Добавьте 800 микролитров одного буфера для химической завивки с помощью многоканальной пипетки во все образцы в кластерных пробирках, не касаясь клеточной гранулы, чтобы уменьшить потерю клеток. Затем отложите в сторону штатив с кластерными пробирками.

Извлеките из 20-плексного набора палладиевого штрих-кодирования трубки с температурой минус 20 градусов Цельсия и разморозьте при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров одного буфера для химической завивки с штрих-кодированием, тщательно перемешайте и перенесите 120 микролитров повторно суспендированной смеси штрих-кодов в соответствующие образцы клеток в кластерных пробирках. Тщательно перемешивайте с помощью многоканальной пипетки, чтобы не было перекрестного загрязнения между образцами с индивидуальными штрихкодами.

Инкубируйте кластерные пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы штрих-коды могли маркировать клетки. Через 30 минут центрифугируйте образцы при 600-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте их в одном миллилитре CSM.

Затем центрифугирование и повторная суспендия в CSM. После этого центрифугируйте при 600-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре и отсасывайте надосадочную жидкость. С помощью одной пипетки и с помощью одного и того же наконечника перенесите все клеточные гранулы в остаточном объеме примерно от 70 до 80 микролитров в одну полистирольную пробирку.

Не выталкивайте наконечник пипетки. Отложите в сторону одну пипетку с этим наконечником. С помощью многоканальной пипетки и новых наконечников добавьте 100 микролитров CSM в каждую исходную кластерную пробирку, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток.

С помощью одной пипетки с отведенным в сторону наконечником перенесите все клеточные гранулы в 100 микролитров остаточного объема в ту же полистирольную пробирку. Добавьте CSM, чтобы долить полистирольную трубку примерно до трех миллилитров. Подсчитайте и запишите номер ячейки объединенного набора штрихкодов.

Затем центрифугируйте при 600-кратном перегрузке в течение пяти минут при комнатной температуре и отсасывайте надосадочную жидкость. Приступайте к окрашиванию образцов со штрих-кодом в тот же день. На этой схеме показан рабочий процесс стимуляции и обработки образцов периферической крови, включая распределение аликвот образца крови, время добавления стимулирующих агентов, коктейль ингибиторов транспорта белка и время инкубации до лизиса и фиксации эритроцитов.

Выбор стимулирующих агентов будет зависеть от сигнальных и цитокиновых путей, которые являются мишенью для оценки. После фиксации и лизиса эритроцитов отдельные лизированные, фиксированные образцы клеток здорового донора были помечены штрих-кодом, помечены 26 антителами против поверхностных маркеров, пермеабилизированы и окрашены 14 антителами против цитокинов. Здесь показана стратегия ограниченного гейтирования, представляющая собой идентификацию моноцитов с высоким уровнем CD14.

Слева направо каждый представленный 2D-график представляет собой подмножество популяции от родительской популяции, которая ограничена 2D-графиком непосредственно слева. Используя моноциты с высоким уровнем CD14 в качестве репрезентативных в восьми субпопуляциях иммунных клеток, был проведен анализ масс-цитометрии на образцах периферической крови здорового донора в нулевое время без стимуляции и после стимуляции агонистом TLR LPS и R848 и активатором Т-клеток PMA иономицином. Приведен пример индукции цитокинов в моноцитах с высоким уровнем CD14 и изображены выбранные цитокины со специфичностью к используемому стимулирующему агенту.

R848 селективно индуцирует субъединицу IL-12p40 и MCP1 в моноцитах с высоким уровнем CD14, в то время как ЛПС этого не делает. Напротив, иономицин PMA не индуцирует цитокины в моноцитах с высоким уровнем CD14. После освоения стимуляция крови может быть выполнена примерно за семь часов, а этап штрих-кодирования может быть выполнен всего за час.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о времени выполнения шагов и соответствующим образом планировать заранее. После того, как вы проведете эту процедуру, вы можете рассмотреть возможность изменения условий стимуляции крови на панели масс-цитометрии, чтобы оценить реакции иммунных клеток, которые специфичны для ваших собственных исследовательских целей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вызвать цитокиновый ответ из образцов цельной крови и как объединить несколько образцов в набор со штрих-кодом для анализа массовой цитометрии.