Подготовка проб для анализа Масс-цитометрии

Общая цель этого процесса подготовки образцов заключается в получении надежного и последовательного окрашивания антителами различных образцов для исследования гетерогенных клеточных популяций. Этот метод может помочь ответить на вопросы о клеточной идентичности, клеточной сигнализации и клеточном ответе в сложной гетерогенной клеточной популяции. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет измерять уровни белка с высокими параметрами на уровне отдельных клеток.

Демонстрировать эту процедуру будет Ундриетта Дункан, аспирант нашей лаборатории. Для каждого образца суспензии одиночных клеток повторно суспендируйте его в соотношении от четырех до 10 до 6 клеток на миллилитр в свободной от сыворотки среде, добавьте 500 микролитров свежеприготовленного 50 MicroMolar Cisplatin на 2/10 в шесть клеток и инкубируйте образцы на орбитальном шейкере с постоянным перемешиванием при комнатной температуре. Через одну минуту охладите цисплатин равным объемом промывочного буфера и центрифугируйте ячейки.

Выбросьте надосадочную жидкость и промойте образцы еще два раза, добавив 500 микролитров буфера для промывки, центрифугируя ячейки и слив буфер для промывки. После этого сделайте две промывки в 500 микролитрах PBS, аналогичным образом центрифугируя образцы и отбрасывая надосадочную жидкость. После второй промывки PBS повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах свежего PBS и зафиксируйте ячейки 500 микролитрами 4% PFA.

Пипеткой перемешайте клетки. Затем поместите образцы на орбитальный шейкер с постоянным перемешиванием в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации гранулируйте клетки методом центрифугирования, слейте надосадочную жидкость, а затем промойте в свежем PBS.

Чтобы проникнуть в клетки, снова понизьте их и отбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте образцы в остаточной PBS путем осторожного вортексирования и немедленно добавьте один миллилитр 100% метанола на 2/10 в шестые клетки с помощью щадящего пипетирования. Инкубируйте образцы при четырех градусах в течение не менее одного часа, а в конце инкубации центрифугируйте клетки.

После этого слейте метанол. Затем промойте гранулы в одном миллилитре буфера для промывки на каждый миллилитр метанола, после чего еще две промывки в 500 микролитрах свежего буфера для промывки. С помощью пипетки объемом 200 микролитров, установленной на 50 микролитров, переложите оставшийся буфер промывки от каждой гранулы в пробирку с соответствующим коктейлем антител.

Пипетка подает обратно в комбинированный раствор, не всасывая воздух в наконечник, удерживая поршень частично нажатым. Затем переложите наконечник пипетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров буфера для промывки, не отпуская поршень. Отпустите поршень, вытянув промывочный буфер для общего объема коктейля антител 50 микролитров, и пометьте соответствующий образец аспирированным коктейлем антител с помощью осторожного пипетирования.

Через час при комнатной температуре при постоянном встряхивании промойте образцы четыре раза, каждый раз сливая промывочный буфер. Чтобы пометить клетки иридием, окончательные гранулы повторно суспендируют в 500 микролитрах PBS с последующим добавлением 500 микролитров четырехпроцентного PFA в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее добавьте в образцы 500 микролитров свежеприготовленного 62,5 наномолярного иридия и PFA еще на 15 минут встряхивания при комнатной температуре.

Затем центрифугируйте ячейки, слейте надосадочную жидкость, а затем проведите две промывки в 500 микролитрах 0,1 процента BSA и отфильтрованной деионизированной воде. Анализируйте образцы, добавляя нормализующие шарики в лунки планшетов для образцов, пипетируя клетки в эти лунки и затем выполняя массовую цитометрию в течение 24 часов. После нормализации интенсивности сигнала калибровочные шарики могут быть удалены из данных путем стробирования положительной популяции шариков иридия-191.

События одиночных клеток затем могут быть забиты для удаления мусора и мультиплетов клеток с использованием биаксиального графика зависимости негативной экспрессии иридия-193 от длины события. Мечение цисплатином может быть использовано для измерения количества глубины клеток. Например, здесь показаны образцы с низким и большим количеством мертвых клеток.

Мертвые клетки могут быть удалены путем удаления популяции с положительной платиной 198, штрихкодирование приводит к четкому разделению образцов в параметрах штрих-кодирования, что позволяет соотнести клетки с их исходной идентичностью образцов. Маркировка IDU может быть использована для обнаружения наблюдаемых здесь клеток лица УЗИ. После первоначальной нормализации, дештрихкодирования и стробирования данные высокой размерности могут быть проанализированы с использованием алгоритма SPADE для создания представления данных меньшей размерности, которое лучше поддается визуальной интерпретации.

После освоения этой техники она может быть завершена в течение четырех-шести часов при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры важно помнить о минимизации потерь образца на этапе промывки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить образцы для анализа на массовую цитометрию.

Не забывайте, что работа с азидом натрия может быть опасной, поэтому при выполнении этой процедуры следует использовать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих СИЗ.