Гибридомная технология получения моноклональных антител против металлопептидазы

Возьмем мышь, иммунизированную металлопептитазой. Соберите данные из селезенки и получите клеточную суспензию.

Отфильтруйте суспензию через сетку и центрифугу, удаляя остатки тканей.

Выделенные клетки включают металлопептидазо-специфичные В-клетки, продуцирующие антитела против эпитопов металлопептидазы.

Добавьте бессмертные клетки миеломы, в которых отсутствует фермент HGPRT, препятствующий спасению нуклеотидных оснований для синтеза нуклеотидов. Они выживают за счет синтеза нуклеотидов de novo.

Центрифугу для получения гранул и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте ПЭГ и инкубируйте, индуцируя слияние миеломы-В-клеток с образованием HGPRT-положительных бессмертных гибридом.

Добавьте среду HAT, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Перенос в лунки, содержащие питательный слой перитонеальных макрофагов, способствующий росту гибридомы.

Аминоптерин блокирует синтез нуклеотидов de novo, вызывая гибель неслившихся клеток миеломы. Неслившиеся В-клетки погибают из-за своей короткой продолжительности жизни.

HGPRT-положительные гибридомы сохраняют нуклеотидные предшественники гипоксантин и тимидин, пролиферируют и секретируют моноклональные антитела, специфичные для металлопептидазы.

Соберите надосадочную жидкость, чтобы подтвердить выработку антител с помощью последующих анализов.

Для начала внутрибрюшинно введите 100 микрограммов белка APM выбранным взрослым самкам мышей для окончательного усиления антигена. После 3 дней инъекции соберите селезенку у мышей, и дважды промойте DMEM, чтобы удалить кровь и жировые клетки.

Отфильтруйте суспензию клеток селезенки с помощью медной сетки 200 меш для удаления остатков тканей и соберите клетки селезенки с помощью центрифугирования для удаления мембраны селезенки. Посейте мышиные клетки миеломы SP2/0 в колбу площадью 25 квадратных сантиметров, содержащую 5 миллилитров DMEM с добавлением 6% эмбриональной бычьей сыворотки, и культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 6% углекислого газа в атмосфере для поддержания жизнеспособности клеток.

Через 5–6 дней культивирования клетки должны достичь 80–90% конфлюенции после реанимации и казаться круглыми, яркими и четкими под микроскопом. За сутки до гибридизации соберите макрофаги из брюшинных полостей мышей.

Затравите перитонеальные макрофаги в плотности от 0,1 до 0,2 умножить на 10 на пятую на миллилитр в 96-луночные планшеты, каждый из которых содержит 100 микролитров среды HAT, и инкубировать их в течение ночи. Для гибридизации мягко отсасывают клетки SP2/0 с помощью пипетки от 8 до 10 флаконов и ресуспендируют их в 10 миллилитрах бессывороточной среды DMEM.

Промойте клетки свежим DMEM и дважды центрифугируйте их, затем повторно суспендируйте в 10 миллилитрах DMEM. Смешайте количественно определенные клетки селезенки с клетками SP2/0 в соотношении 10 к 1 и перенесите их в 50-миллилитровые пробирки.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и соберите гранулы на дно пробирок. Постучите по трубке, чтобы ослабить гранулы перед гибридизацией. С помощью пипетки добавьте 1 миллилитр полиэтиленгликоля 1500, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия, по каплям в разрыхленную клеточную гранулу в течение 45 секунд, осторожно вращая дно пробирки.

Затем медленно добавьте в смесь 1 миллилитр предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия DMEM на 90 секунд, а затем еще 30 миллилитров свежего DMEM и поместите термоядерную трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут.

После инкубации соберите клетки. Ресуспендируйте среду и культуру HAT в 96-луночном планшете, инокулированном перитонеальными макрофагами. Через 5 дней добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежей среды HAT. И снова, после 5 дней инкубации, замените среду на среду HT. Используйте микротитировальную пластину, покрытую 5 мкг на миллилитр белка APN, разведенного в 0,05 молярного PBS, для анализа моноклональных антител в супернатанте гибридомы с помощью анализа ИФА.