Анализ активации дендритных клеток с помощью проточной цитометрии с использованием иммунных комплексов

Начните с химически закрепленной суспензии опухолевых клеток.

Добавьте оптимальную концентрацию опухолесвязывающего иммуноглобулина G, который связывается с поверхностными антигенами опухолевых клеток, образуя иммунные комплексы или IC.

Перенесите IC в культуральную пластину, содержащую адгезивные дендритные клетки. Инкубировать.

Дендритная клетка распознает IC, интернализует ее и перерабатывает в пептидные фрагменты.

Фрагменты загружаются на молекулы основного комплекса гистосовместимости класса II или MHC-II и представляются на поверхности клетки вместе с костимулирующей молекулой CD86.

Удалите носитель. Добавьте буфер для диссоциации клеток и энергично используйте пипетку, чтобы отсоединить клетки.

Переложите клетки в пробирку.

Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в блокирующем растворе, чтобы блокировать неспецифические взаимодействия.

Наложение с помощью меченного флуорофором коктейля антител, нацеленного на MHC-II и CD86.

Добавьте ДНК-связывающий краситель и кратковременно инкубируйте, чтобы окрашивать ядра мертвых клеток.

С помощью проточной цитометрии идентифицировать живые клетки, совместно экспрессирующие MHC-II и CD86, подтверждая IC-опосредованную активацию дендритн