Анализ активации дендритных клеток с помощью проточной цитометрии с использованием иммунных комплексов
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 3:35 мин • July 8th, 2025
Начните с химически закрепленной суспензии опухолевых клеток.
Добавьте оптимальную концентрацию опухолесвязывающего иммуноглобулина G, который связывается с поверхностными антигенами опухолевых клеток, образуя иммунные комплексы или IC.
Перенесите IC в культуральную пластину, содержащую адгезивные дендритные клетки. Инкубировать.
Дендритная клетка распознает IC, интернализует ее и перерабатывает в пептидные фрагменты.
Фрагменты загружаются на молекулы основного комплекса гистосовместимости класса II или MHC-II и представляются на поверхности клетки вместе с костимулирующей молекулой CD86.
Удалите носитель. Добавьте буфер для диссоциации клеток и энергично используйте пипетку, чтобы отсоединить клетки.
Переложите клетки в пробирку.
Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в блокирующем растворе, чтобы блокировать неспецифические взаимодействия.
Наложение с помощью меченного флуорофором коктейля антител, нацеленного на MHC-II и CD86.
Добавьте ДНК-связывающий краситель и кратковременно инкубируйте, чтобы окрашивать ядра мертвых клеток.
С помощью проточной цитометрии идентифицировать живые клетки, совместно экспрессирующие MHC-II и CD86, подтверждая IC-опосредованную активацию дендритных клеток.
Сначала зафиксируйте клетки в 1,8% буферизованном параформальдегиде на 10 минут при комнатной температуре. Засейте клеточную суспензию в каждую лунку U-образной 96-луночной пластины. Затем добавьте различные разведения опухолесвязывающих антител в каждую лунку. После этого инкубируйте клетки на льду в течение 15-20 минут.
После инкубации промойте клетки 150 микролитрами фосфатно-солевого буфера, затем центрифугируйте при 400-кратном избежании в течение 5-10 минут при 4 градусах Цельсия. После центрифугирования изгнать надосадочную жидкость и дважды промыть клетки. Растворите клетки в 100 микролитрах буфера FACS, содержащего флуорконъюгированное вторичное антитело. Далее выдержите тарелку на льду в течение 15 – 20 минут.
Через 15-20 минут добавьте 200 микролитров буфера FACS для промывания клеток. Центрифугируйте планшет при 400-кратном передозировке г в течение 5-10 минут. Сцедите надосадочную жидкость. Проведите проточную цитометрию для анализа связывания опухоли, а также для определения минимальной концентрации иммуноглобулина G, необходимой для покрытия клеток.
После того, как клетки покрыты минимальной концентрацией иммуноглобулина G, добавьте меченный CFSE иммунный комплекс опухоли к дендритным клеткам, полученным из моноцитов, в соотношении 1:5. Затем инкубируйте смесь в течение 12-16 часов в течение ночи в полной среде. Выполните FACS-анализ активации дендритных клеток, полученных из моноцитов.
Обзор
В данной статье описывается метод активации дендритных клеток с помощью опухолесвязывающего иммуноглобулина G и иммунных комплексов. Процесс включает инкубацию дендритных клеток с этими комплексами с последующим анализом методом проточной цитометрии для подтверждения активации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Обзор
- Дендритные клетки играют важнейшую роль в иммунном ответе.
- Активация дендритных клеток может усилить противоопухолевый иммунитет.
- Иммунные комплексы могут способствовать захвату антигенов дендритными клетками.
- Проточная цитометрия является ключевым методом анализа поверхностных маркеров клеток.
Цель исследования
- Разработать протокол активации дендритных клеток с использованием антител, связывающихся с опухолью.
- Оценить эффективность иммунных комплексов в стимулировании дендритных клеток.
- Проанализировать экспрессию MHC-II и CD86 как маркеров активации.
Используемые методы
- Приготовление суспензии опухолевых клеток и иммунных комплексов.
- Инкубация дендритных клеток с иммунными комплексами.
- Проточная цитометрия для анализа маркеров клеточной поверхности.
- Использование меченных флуорофором антител для детекции.
Основные результаты
- Успешная интернализация иммунных комплексов дендритными клетками.
- Повышенная экспрессия MHC-II и CD86 на активированных дендритных клетках.
- Проточная цитометрия подтвердила статус активации дендритных клеток.
Выводы
- Данный метод эффективно активирует дендритные клетки с использованием антител, связывающихся с опухолью.
- Проточная цитометрия является надежным методом оценки активации дендритных клеток.
- Этот подход может улучшить стратегии иммунотерапии рака.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет функционально подтвердить активацию дендритных клеток посредством захвата антигена, опосредованного иммунными комплексами, что обеспечивает получение механистических данных для оценки перспективных иммуномодулирующих кандидатов. Связывая процессинг антигена с экспрессией MHC-II и CD86 на поверхности клеток, этот метод способствует снижению рисков при выборе мишеней в программах по иммуноонкологии. Считывание результатов с помощью проточной цитометрии предоставляет количественные, воспроизводимые данные для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Изучение путей активации дендритных клеток посредством интернализации и презентации антигена.
- Практическая ценность: Использование коэкспрессии MHC-II и CD86 в качестве функциональных биомаркеров компетентности антигенпрезентирующих клеток.
- Прогностическая ценность: Позволяет снизить механические риски при разработке иммуномодуляторов путем подтверждения способности к процессингу антигена.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных показателей активации дендритных клеток для скрининга соединений.
- Количественный выход: проточная цитометрия измеряет коэкспрессию MHC-II и CD86 в качестве показателей активации.
- Воспроизводимость: определенные протоколы инкубации и окрашивания поддерживают передачу анализа между исследовательскими группами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует функцию антигенпрезентирующих клеток в контексте иммунного ответа опухоли.
- Трансляционная преемственность: Связывает активацию in vitro с потенциалом адаптивного иммунного ответа.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает принятие решений о продолжении или прекращении исследований на основе функциональной компетенции дендритных клеток.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум поиска в области иммуноонкологии — от валидации мишени до оптимизации ведущего соединения, при этом активация дендритных клеток служит предиктором иммунотерапевтического потенциала.
- Фундаментальная биология: Проверка гипотез о поглощении и переработке антигенов дендритными клетками.
- Скрининг: Получение воспроизводимых показателей активации для профилирования иммуномодуляторов.
- Аналитика: Получение данных о коэкспрессии MHC-II/CD86 для сравнения эффектов различных соединений.
- Трансляционные исследования: Установление связи между активацией дендритных клеток и потенциалом прайминга T-клеток.
- Повторное использование в организации: Создание воспроизводимой платформы для характеристики иммуномодуляторов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Подтверждает способность к процессингу и презентации антигена в качестве механистического биомаркера.
- Практическая ценность: Стандартизированный рабочий процесс проточной цитометрии обеспечивает воспроизводимость анализа.
- Стратегическая ценность: Улучшает прогнозирование эффективности иммуномодуляторов в доклинических моделях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов на основе рисков при подтвержденной активации дендритных клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами дендритных клеток и проточной цитометрией.
- Зависимость от наличия конъюгированных с флуорофорами антител и доступа к проточному цитометру.
- Необходима стандартизация приготовления иммунных комплексов и соотношения дендритных клеток.
- Адаптация к человеческим или специфическим для конкретного заболевания моделям может потребовать оптимизации.
- Ограничено показателями активации; не фиксирует последующие Т-клеточные ответы.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия
Похожие видео
0 Просмотры
В экстракорпоральная стимуляция и визуализация внеклеточной ловушки релиз в дифференцированных человеческих моноцитов полученных макрофагов
Похожие видео
0 Просмотры
Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота
Похожие видео
0 Просмотры
IP-FCM: Иммунопреципитация обнаружен с помощью проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Распознавание CD-маркеров цитокин-индуцированных клеток киллеров человека методом проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ проточной цитометрии для идентификации субпопуляций иммунных клеток в мононуклеарных клетках периферической крови
Похожие видео
0 Просмотры
Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Протокол изоляции моноцитарных дендритных клеток мыши и их последующее в Vitro активации с опухоли иммунных комплексов
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026