Анализ активации дендритных клеток с помощью проточной цитометрии с использованием иммунных комплексов

Начните с химически закрепленной суспензии опухолевых клеток.

Добавьте оптимальную концентрацию опухолесвязывающего иммуноглобулина G, который связывается с поверхностными антигенами опухолевых клеток, образуя иммунные комплексы или IC.

Перенесите IC в культуральную пластину, содержащую адгезивные дендритные клетки. Инкубировать.

Дендритная клетка распознает IC, интернализует ее и перерабатывает в пептидные фрагменты.

Фрагменты загружаются на молекулы основного комплекса гистосовместимости класса II или MHC-II и представляются на поверхности клетки вместе с костимулирующей молекулой CD86.

Удалите носитель. Добавьте буфер для диссоциации клеток и энергично используйте пипетку, чтобы отсоединить клетки.

Переложите клетки в пробирку.

Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в блокирующем растворе, чтобы блокировать неспецифические взаимодействия.

Наложение с помощью меченного флуорофором коктейля антител, нацеленного на MHC-II и CD86.

Добавьте ДНК-связывающий краситель и кратковременно инкубируйте, чтобы окрашивать ядра мертвых клеток.

С помощью проточной цитометрии идентифицировать живые клетки, совместно экспрессирующие MHC-II и CD86, подтверждая IC-опосредованную активацию дендритных клеток.

Сначала зафиксируйте клетки в 1,8% буферизованном параформальдегиде на 10 минут при комнатной температуре. Засейте клеточную суспензию в каждую лунку U-образной 96-луночной пластины. Затем добавьте различные разведения опухолесвязывающих антител в каждую лунку. После этого инкубируйте клетки на льду в течение 15-20 минут.

После инкубации промойте клетки 150 микролитрами фосфатно-солевого буфера, затем центрифугируйте при 400-кратном избежании в течение 5-10 минут при 4 градусах Цельсия. После центрифугирования изгнать надосадочную жидкость и дважды промыть клетки. Растворите клетки в 100 микролитрах буфера FACS, содержащего флуорконъюгированное вторичное антитело. Далее выдержите тарелку на льду в течение 15 – 20 минут.

Через 15-20 минут добавьте 200 микролитров буфера FACS для промывания клеток. Центрифугируйте планшет при 400-кратном передозировке г в течение 5-10 минут. Сцедите надосадочную жидкость. Проведите проточную цитометрию для анализа связывания опухоли, а также для определения минимальной концентрации иммуноглобулина G, необходимой для покрытия клеток.

После того, как клетки покрыты минимальной концентрацией иммуноглобулина G, добавьте меченный CFSE иммунный комплекс опухоли к дендритным клеткам, полученным из моноцитов, в соотношении 1:5. Затем инкубируйте смесь в течение 12-16 часов в течение ночи в полной среде. Выполните FACS-анализ активации дендритных клеток, полученных из моноцитов.