Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации детальной морфологии нейронов дрозофилы, личинок, дендритных, арборизационных нейронов. Это достигается путем сбора эмбрионов, их старения и создания генетических клонов, меченных GFP, путем индуцированной тепловым шоком экспрессии липазы. Второй шаг — выбрать личинки с клонами флуоресцентных нейронов и получить изображение их дендритных АБК.

После визуализации лавы их препарируют, фиксируют и окрашивают иммуно, чтобы их можно было установить, а их дендритные гавани и концевые морфологии аксонов можно визуализировать с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. Сегодня я продемонстрирую протокол морфологического анализа OID и экзонов нижних периферических сенсоров sula с использованием генетических mos. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроразвития, такие как какие генетические программы контролируют нейронную идентичность, форму дендритной полости рта и внешнюю проводку?

Начните этот протокол со сбора эмбрионов на тарелках с яблочным соком. Тепловой шок осуществляется на водяной бане при температуре 38 градусов Цельсия, а продолжительность варьируется в зависимости от генетики эмбриона и желаемых размеров клона. Для этого протокола создайте клоны маркума из эмбрионов с помощью драйвера нейронов дендритной арборизации pand Перед тепловым шоком держите маркерные эмбрионы при температуре 25 градусов Цельсия в окружении влажных тканей в течение двух часов.

Подготовьте сборные пластины к тепловому удару, сделав их погружаемыми в воду с помощью пустых тарелок и пара-заполнения. Затем тепловой шок маркерных эмбрионов в течение часа, чтобы создать маленькие клоны или мечение одного нейрона. Чтобы увеличить количество клонов, используйте расширенный тепловой шок путем инкубации в течение 45 минут в ванне, затем 30 минут при комнатной температуре, а затем еще 30 минут в ванне.

Чтобы создать откидные клоны, собирайте эмбрионы в течение 24 часов непрерывно. В этом протоколе используется драйвер, специфичный для четвертого класса. Тепловой шок подвергнет переворачивающиеся эмбрионы в течение часа после теплового шока.

Поместите тарелки для сбора в 10-сантиметровую чашку Петри в окружении влажных салфеток и культуры. Эмбрионы находятся при температуре 25 градусов Цельсия во время культивирования эмбрионов и пополняют дрожжевую пасту по мере необходимости. Потому что питание критически влияет на развитие нейронов.

Поддерживайте культуру до тех пор, пока блуждающая третья по звезде лава не сможет быть собрана ненадолго и аккуратно промойте личинки третьего возраста в водопроводной воде и переложите их на агаровую пластину. Теперь рассмотрите личинки с помощью мощного флуоресцентного препарирующего микроскопа и щипцов насекомых. Определите личинки с GFP-положительными нейронами в стенке тела и перенесите их на горку депрессии с каплей 80% глицерина.

Поместите на предметное стекло защитный листок, чтобы обездвижить лаву. Следите за тем, чтобы между лавой и покровным стеклом не оставалось воздуха. Используйте стандартную конфокальную микроскопию для визуализации интересующих нейронов через лавовую кутикулу.

Чтобы изменить положение лавы для улучшения угла обзора, осторожно нажмите на защитный слип, чтобы прокатить лаву. Начните этот протокол с переноса лавы на защитную пластину SIL с помощью щипцов насекомых. Затем приколите его на переднем и заднем концах.

Затем добавьте буфер HL 3.1 без кальция. Теперь разрежьте посередине оба конца лавы перпендикулярно передней задней оси. Затем разрежьте по средней линии между двумя трахеями.

Осторожно разрежьте каждое отдельное трахейное соединение со стенкой тела, прежде чем аккуратно удалить кишечник. Это сохраняет сегментарные нервы, проходящие между ПНС и ЦНС, неповрежденными. Когда личинка все еще прикреплена к защитной пластине клетки, закрепите ее в 4%-ном параформальдегиде в PBS на 20 минут комнатной температуры на мягко вращающемся шейкере, выполняйте каждое вскрытие менее чем за пять минут.

В противном случае ниты дендритных нейронов авторизации начнут деградировать. После фиксации удалите лишние личиночные ткани. Затем промойте филе три раза с PBST в течение 10 минут за одну стирку.

После промывок выдержать в течение 20 минут комнатной температуры в блокирующем растворе с легким встряхиванием. После завершения блокировки замените блокирующий раствор первичным раствором антитела. Поместите образец в небольшой пластиковый контейнер, окруженный влажными салфетками, и инкубируйте его в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день продолжайте инкубацию еще на час при комнатной температуре.

Затем шесть раз промойте галтели лавы в PBST в течение 10 минут за промывку. Теперь добавьте вторичное антитело и положите филе в темную емкость, чтобы предотвратить фотообесцвечивание фтором. Инкубируйте филе в течение нескольких часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, а затем в течение одного часа при комнатной температуре.

Наконец, промойте филе шесть раз в PBST в течение 10 минут за одну стирку. После этого ткани готовы к монтажу. Чтобы визуализировать концы аксонов, просто установите филе личинок кутикулой вниз с содержанием 80% глицерина на предметное стекло с углублением.

Чтобы получить более четкие изображения дендритов, сделайте постоянное крепление с защитными накладками с покрытием PLL. Для маркировки обложки необходимо указать и аликвоту ФАПЧ. Доведите его до 10 миллилитров дважды дистиллированной воды и добавьте 20 микролитров фотопотока Kodak.

Погрузите покровные стекла на 30 минут в раствор ФАПЧ и высушите их на воздухе после снятия. Затем коротко промойте их водой и воздухом. Снова просушите их.

Повторите этот процесс дважды. Начиная с ванны с ФАПЧ, обработанные покровные накладки прослужат примерно один месяц. Теперь смонтируйте рассеченное филе личинки мышечной стороной вниз в каплю PBS на покровном листе ФАПЧ.

Скругление будет быстро прилипать к покровному листу с помощью листа папиросной бумаги. Удалите как можно больше жидкости, однако не допускайте ее полного высыхания. Затем обезвоживаем филе личинок и серия 10-минутных ванн с этанолом, начиная с 35% этанола, затем 50%, затем 70%, затем 95%, затем 100% и, наконец, вторая, 100% этаноловая ванна.

После ванн с этанолом следует две-три 10-минутные ванны в ксилоле. Затем нанесите каплю DPX на чистое предметное стекло и осторожно установите защитное стекло в DPX, заполните его стороной вниз. Держите слайд в темноте и подождите один день, пока DPX не схватится.

Перед визуализацией ткани с помощью in vivo и фокальной микроскопии можно получить такие изображения. Вся беседка нейронов дендритной арборизации четвертого класса. Это крупный план дендритной беседки из меченого IHC нейрона третьего класса, который был правильно зафиксирован для сохранения морфологии.

На врезке показана деградация, которая может произойти после неудачного рассечения и фиксации. На этом наложении показан один конец аксона четвертого класса в ЦНС. Аксон помечен анти-GFP зеленым цветом, а все термиты четвертого класса окрашены анти-CD-двойкой пурпурного цвета.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости быстро препарировать и фиксировать образцы, отслеживая аксоны от периферии к ЦНС. Полезно иметь в виду, что нейроны ПНС в каждом организме будут сегментировать проекцию на когнитивный сегмент кода вентиляционного нерва. Кроме того, если вы хотите визуализировать только дендриты, удалите CNA во время диссекции, а окрашивание можно проводить в приставке трубок, а не на пластинах.

При монтаже этих филе для визуализации дендритов сначала отрезают головку с крючками для рта и сзади с блестками. Для приятного приготовления.