Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации детальной морфологии дендритных разветвлений нейронов личинок Drosophila. Для этого сначала собирают эмбрионы, выдерживают их до определенного возраста и создают генетические клоны, меченные GFP, путем экспрессии lipase, индуцированной тепловым шоком. На втором этапе отбирают личинок с флуоресцентными клонами нейронов и делают снимки их дендритных ABAs.

После получения изображений лавы они подвергаются диссекции, фиксации и иммуноокрашиванию для последующего монтирования, что позволяет визуализировать морфологию их дендритных гаваней и аксональных терминалей с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. Сегодня я продемонстрирую протокол морфологического анализа sula нижних периферических сенсорных OID и экзонов с использованием генетических мозаик. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроразвития, такие как: какие генетические программы контролируют нейрональную идентичность, форму дендритов и внешнюю проводку?

Начните выполнение данного протокола со сбора эмбрионов на чашки с яблочным соком. Тепловой шок проводят в водяной бане при температуре 38 °C, при этом продолжительность воздействия варьируется в зависимости от генотипа эмбрионов и желаемого размера клонов. В данном протоколе создаются клоны markum из эмбрионов с драйвером нейронов панда-дендритной арборизации. Перед тепловым шоком выдерживайте эмбрионы с маркером при температуре 25 °C в окружении влажных салфеток в течение двух часов.

Подготовьте планшеты для сбора образцов к тепловому шоку, сделав их погружными с помощью пустых планшетов и парафильма. Затем подвергните эмбрионы с маркером тепловому шоку в течение одного часа для получения небольших клонов или маркировки одиночных нейронов. Чтобы увеличить количество клонов, используйте продленный тепловой шок: инкубируйте образцы в водяной бане в течение 45 минут, затем 30 минут при комнатной температуре и снова 30 минут в бане.

Для получения клонов flipout собирайте эмбрионы непрерывно в течение 24 часов. В данном протоколе используется специфический драйвер четвертого класса. После теплового шока подвергайте эмбрионы flipout воздействию температуры в течение одного часа.

Поместите планшеты для сбора в чашку Петри диаметром 10 см, окружив их влажными салфетками и питательной средой. В процессе культивирования эмбрионов поддерживайте температуру 25 °C, контролируйте и при необходимости обновляйте дрожжевую пасту, так как питание оказывает критическое влияние на развитие нейронов.

Поддерживайте культуру до момента, когда можно будет собрать личинок третьей стадии развития; осторожно и кратко промойте личинок третьей стадии в водопроводной воде и перенесите их на чашку с агаром. Затем изучите личинок с помощью мощного флуоресцентного диссекционного микроскопа и энтомологического пинцета. Выберите личинок с GFP-положительными нейронами в стенке тела и перенесите их на предметное стекло с углублением, содержащее каплю 80% глицерина.

Поместите покровное стекло на предметное стекло, чтобы зафиксировать личинку. Убедитесь, что между личинкой и покровным стеклом не осталось пузырьков воздуха. Используйте стандартную конфокальную микроскопию для визуализации интересующих нейронов сквозь кутикулу личинки.

Чтобы изменить положение личинки для улучшения угла обзора, осторожно нажмите на покровное стекло, чтобы перекатить личинку. Начните выполнение данного протокола с переноса личинки на защитную пластину SIL с помощью энтомологического пинцета. Затем зафиксируйте её булавками в переднем и заднем концах.

Затем добавьте буфер HL 3.1 без кальция. Теперь сделайте надрезы посередине обоих концов личинки перпендикулярно передне-задней оси. Затем разрежьте вдоль срединной линии между двумя трахеями.

Осторожно перережьте каждое отдельное соединение трахеи со стенкой тела перед тем, как аккуратно извлечь кишечник. Это позволит сохранить целостность сегментарных нервов, проходящих между ПНС и ЦНС. Пока личинка зафиксирована на пластине-ограждении камеры, поместите ее в 4% раствор параформальдегида в PBS на 20 минут при комнатной температуре на шейкере с медленным вращением; каждую процедуру препарирования следует выполнять менее чем за пять минут.

В противном случае нейриты дендритных авторизационных нейронов начнут деградировать. После фиксации удалите излишки тканей личинок. Затем промойте филлеты трижды в PBST, по 10 минут на каждую промывку.

После промывок инкубируйте личинок в течение 20 минут при комнатной температуре в блокирующем растворе при осторожном встряхивании. По завершении блокировки замените блокирующий раствор раствором первичных антител. Поместите образец в небольшой пластиковый контейнер, окруженный влажными салфетками, и инкубируйте его в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия. На следующий день продолжите инкубацию еще в течение одного часа при комнатной температуре.

Затем промойте филе лавы шесть раз в PBST, по 10 минут на каждую промывку. Теперь добавьте вторичные антитела и поместите филе в темный контейнер, чтобы предотвратить фотовыгорание флуорофора. Инкубируйте филе в течение нескольких часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия, после чего выдержите один час при комнатной температуре.

В завершение промойте филе шесть раз в PBST по 10 минут за одну промывку. После этого ткани готовы к монтированию. Для визуализации терминалей аксонов просто смонтируйте филе личинки кутикулой вниз в 80% glycerol на предметном стекле с лункой.

Для получения более четких изображений дендритов выполните постоянное Mounting с использованием покровных стекол, покрытых PLL. Чтобы промаркировать покровные стекла, используйте аликвот PLL. Доведите объем до 10 milliliters дважды дистиллированной воды и добавьте 20 microliters Kodak photo flow.

Погрузите покровные стекла в раствор PLL на 30 минут, после чего извлеките их и высушите на воздухе. Затем коротко промойте их водой и обдуйте воздухом. Высушите их повторно.

Повторите этот процесс дважды. Начиная с момента погружения в раствор PLL, обработанные покровные стекла будут храниться примерно один месяц. Теперь закрепите препарированную личинку филе мышечной стороной вниз в каплю PBS на покровном стекле с PLL.

Филетированный образец быстро прикрепится к покровному стеклу с помощью кусочка бумажной салфетки. Удалите как можно больше жидкости, однако не допускайте полного высыхания образца. Затем проведите дегидратацию филе личинок в серии 10-минутных ванн с этанолом, начиная с 35% ethanol, затем 50%, далее 70%, затем 95%, затем 100% и, наконец, во второй ванне с 100% ethanol.

После ванн с этанолом проведите две или три десятиминутные промывки в ксилоле. Затем нанесите каплю DPX на чистый предметное стекло и осторожно поместите покровное стекло в DPX, прижимая его лицевой стороной вниз. Храните предметное стекло в темном месте в течение одного дня до полного затвердевания DPX.

Перед проведением визуализации ткани с помощью микроскопии in vivo и фокальной микроскопии можно получить подобные изображения. Весь дендритный арбор нейрона четвертого класса. Это увеличенное изображение дендритного арбора нейрона третьего класса, маркированного методом ИГХ, который был правильно зафиксирован для сохранения морфологии.

На врезке показана деградация, которая может произойти после неудачного препарирования и фиксации. На данном совмещенном изображении виден единственный аксонный терминал четвертого класса в ЦНС. Аксон мечен антителами к GFP (зеленый цвет), а все терминали четвертого класса совместно окрашены антителами к CD2 (пурпурный цвет).

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости быстрого препарирования и фиксации образцов, прослеживая аксоны от периферии к ЦНС. Полезно учитывать, что нейроны ПНС в каждом теле будут сегментарно проецироваться на когнитивный сегмент вентрального нервного кода. Кроме того, если требуется визуализировать только дендриты, удалите ЦНС во время препарирования; в этом случае окрашивание можно проводить в пробирках вместо планшетов.

При закреплении этих филе для визуализации дендритов сначала отсеките голову с помощью ротовых крючков, а заднюю часть — с помощью спаркл-зажимов. Для подготовки препарата.