Визуализация шаблона аксонной проекции эмбриональных моторных нейронов в Drosophila

Общая цель этого эксперимента заключается в анализе проекционных паттернов моторных нейронов у эмбрионов Drosophila melanogaster на поздних стадиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития нейронов, такие как управление моторными аксонами и формирование нейронных субку. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает точную визуализацию моторных аксонов у развивающихся эмбрионов, что позволяет проводить надежный анализ поиска аксональных путей и нацеливаться на дефект состояния.

Через день после установки тарелок для сбора яиц замените их на новые, содержащие немного свежеприготовленной дрожжевой пасты. Через три часа на свежих тарелках переложите мух в новые бутылки с едой. И инкубируйте яичные тарелки в течение ночи при температуре 25 градусов по Цельсию.

Утром добавьте в тарелки 1,8 миллилитра раствора ПБТ. И с помощью ватного тампона выбить эмбрионы. Затем с помощью пипетки объемом 1 миллилитр перенесите эмбрионы и раствор в микроцентрифужную пробирку.

Как только эмбрионы осядут на дно, отасуньте как можно больше раствора. Затем дважды промойте эмбрионы, используя один миллилитр PBT за одно полоскание. Чтобы очистить эмбрионы, замените последнее полоскание одним миллилитром 50% отбеливателя и покачивайте пробирку в течение трех минут при комнатной температуре.

Чтобы удалить отбеливатель, трижды промойте эмбрионы ПБТ. Затем замените последнее полоскание половиной миллилитра 100% гептана и половиной миллилитром 4% параформальдегида. Теперь инкубируйте эмбрионы в течение 15 минут с легким покачиванием.

После инкубации удалите слой нижележащего раствора и добавьте обратно 500 микролитров 100% метанола. Теперь в течение 30 секунд энергично встряхивайте пробирку, чтобы девителлинизировать эмбрионы. Затем удалите вышележащий раствор, добавьте обратно 500 микролитров 100% метанола и встряхивайте пробирку еще 10 секунд.

После встряхивания трубки постучите по ней, чтобы помочь эмбрионам осесть и удалить как можно больше раствора. Далее коротко промойте зародыши со 100% метанолом. Затем сразу же промойте эмбрионы ПБТ три раза.

Теперь ресуспендируйте эмбрионы в одном миллилитре свежего ПБТ. И инкубируйте эмбрионы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы подготовить их к окрашиванию LacZ. Пока эмбрионы инкубируются, приготовьте аликвоту в один миллилитр окрашивающего раствора X-gal.

Прогрейте аликвоту на водяной бане при температуре 65 градусов Цельсия до тех пор, пока не станет мутно. Затем перенесите его в термоблок с температурой 37 градусов Цельсия. После того, как эмбрионы будут прогреты в течение 15 минут, удалите раствор PBT и замените его одним миллилитром аликвоты окрашивающего раствора.

Затем добавьте 20 микролитров субстрата X-gal. В течение примерно двух-четырех часов инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия с легким покачиванием до образования синего осадка. Затем удалите окрашивающий раствор и трижды промойте эмбрионы ПБТ комнатной температуры.

После полоскания с помощью игольчатого зонда или щипцов вручную отсортируйте эмбрионы под микроскопом для вскрытия. Соберите окрашенные эмбрионы в полумиллиметровую микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки объемом в один миллилитровый пипетку. Далее промойте выбранные эмбрионы 0,4 миллилитрами ПБТ.

Затем замените PBT 0,3 миллилитрами блокирующего раствора и дайте эмбрионам инкубироваться с легким перемешиванием в течение 15 минут. Через 15 минут добавьте 75 микролитров первичного антитела и продолжайте инкубацию в течение ночи. На следующее утро промойте эмбрионы PBT в течение примерно двух часов, меняя раствор для промывки примерно каждые 30 минут.

После промывки добавьте 0,3 миллилитра блокирующего раствора, содержащего вторичное антитело, и инкубируйте пробирку при осторожном покачивании при комнатной температуре в течение ночи. На следующее утро промойте эмбрионы PBT в течение примерно трех часов. Меняйте PBT не менее пяти раз в течение периода стирки.

После промывания повторно суспендируйте эмбрионы в 0,3 миллилитра раствора и добавьте два микролитра 3%-ной перекиси водорода. Затем инкубируйте их в темноте с легким покачиванием при комнатной температуре, пока не образуется достаточное количество осадка. Обычно это занимает от 30 до 60 минут.

Затем четыре раза промойте эмбрионы ПБТ и повторно суспендируйте их в 0,2 миллилитра монтажного раствора. Теперь дайте эмбрионам равновеситься в темноте при температуре 4 градуса по Цельсию. Чтобы подпилить эмбрионы, поместите их на предметное стекло.

Сначала переместите их в каплю глицерина вентральной стороной вверх. Далее под микроскопом вскрытия отрезают переднюю часть и 1/4 длины тела и удаляют самую заднюю область, которая свободна от моторных аксонов. Теперь с помощью игольчатого щупа выведите препарат из глицерина тыльной стороной вверх и расположите его горизонтально в поле зрения.

На следующем этапе требуется тонкая вольфрамовая игла, которая была вставлена в полую область игольчатого зонда, а затем согнута на конце. С помощью вольфрамовой иглы сделайте небольшой надрез на заднем конце эмбриона и продолжайте срезать дорсальную среднюю линию. Следите за тем, чтобы кончик вольфрамовой иглы не касался поверхности предметного стекла во время вскрытия, потому что игла будет легко пригибаться к стеклу.

Затем с помощью зонда верните препарат обратно в каплю глицерина и расположите его тыльной стороной вверх. Там отделите кишку от стенки тела, развернув каждую стенку тела в вентрально-латеральном направлении. Две стенки корпуса должны разойтись.

Теперь с помощью щупа осторожно переместите створки стенки корпуса на предметное стекло. На предметном стекле с помощью вольфрамовой иглы удалите внутренние органы, толкая их в сторону. Чтобы стабилизировать вольфрамовую иглу и предотвратить ее повреждение, держите полую иглу в контакте и удерживайте вольфрамовую иглу прикрепленной к поверхности предметного стекла во время манипуляций с вольфрамовой иглой.

Теперь смонтируйте препараты в восьми микролитрах монтажного раствора на новое предметное стекло. Прикрепите чехол и заклейте края обычным лаком для ногтей. Затем делайте снимки с высоким разрешением с помощью оптики DIC.

С помощью описанного метода эмбрионы 16 стадии окрашивали антителом к Fas2 и готовили к визуализации моторных нейронов и абдоминальных полусегментов А3 и А4. В норме, по крайней мере, семь моторных нейронов удлиняются и фасцикулируют свои аксоны, образуя нервную ветвь ISNb. Многие окружающие нервные пучки также были идентифицированы в этом препарате. Когда межсегментарный нервный пучок достигает точки выбора в мышцах 6 и 7, два аксона избирательно дефасцикулируют и ослабляют мышцы 6 и 7.

То же самое происходит и в других точках выбора, поскольку пучок простирается дорсально. Затем, в последней точке выбора, два аксона ослабляют мышцу 12. Напротив, у мутантных эмбрионов Sema-1a те же аксоны не дефасцикулируются в точках своего выбора.

В этом нет ничего неожиданного, поскольку известно, что эгейский продукт Sema-1 помогает формировать связи между моторными аксонами и мышцами-мишенями во время развития нервной системы. Таким образом, описанный метод может быть использован для анализа мутантных фенотипов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как сортировать нужные мутантные эмбрионы, как иммуноокрашивать проекционные паттерны аксональных нейронов моторных нейронов и как препарировать неподвижные эмбрионы для плоской подготовки.