Визуализация шаблона аксонной проекции эмбриональных моторных нейронов в

Общая цель данного эксперимента — проанализировать паттерны проекций мотонейронов в эмбрионах Drosophila melanogaster на поздних стадиях развития. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области развития нервной системы, такие как механизмы наведения моторных аксонов и формирование нейронных субциркуитов. Основным преимуществом данной методики является точная визуализация моторных аксонов в развивающихся эмбрионах, что позволяет проводить достоверный анализ путей прохождения аксонов и определять характер дефектов мишеней.

Через один день после подготовки планшетов для сбора яиц замените их новыми, содержащими небольшое количество свежеприготовленной дрожжевой пасты. Через три часа пребывания на новых планшетах перенесите мух в новые флаконы с кормом. Инкубируйте планшеты с яйцами в течение ночи при температуре 25 °C.

Утром добавьте в планшеты 1,8 мл раствора PBT. Используя ватную палочку, вытесните эмбрионы. Затем с помощью дозатора на 1 мл перенесите эмбрионы вместе с раствором в микроцентрифужную пробирку.

Когда эмбрионы осядут на дно, аспирируйте максимально возможный объем раствора. Затем дважды промойте эмбрионы, используя по 1 мл PBT для каждого промывания. Для удаления хориона замените последнее промывание 1 мл 50% раствора гипохлорита натрия и перемешивайте содержимое пробирки на ротаторе в течение трех минут при комнатной температуре.

Для удаления отбеливателя трижды промойте эмбрионы в PBT. Затем замените последний промывочный раствор на 0,5 мл 100% гептана и 0,5 мл 4% параформальдегида. После этого инкубируйте эмбрионы в течение 15 минут при осторожном покачивании.

После инкубации удалите нижний слой раствора и добавьте 500 microliters 100%methanol. Затем в течение 30 секунд интенсивно встряхивайте пробирку для девителлинизации эмбрионов. После этого удалите верхний слой раствора, снова добавьте 500 microliters 100%methanol и встряхивайте пробирку еще в течение 10 секунд.

После встряхивания пробирки осторожно постучите по ней, чтобы эмбрионы осели, и удалите как можно больше раствора. Затем кратко промойте эмбрионы в 100% метаноле. После этого немедленно трижды промойте эмбрионы в PBT.

Теперь ресуспендируйте эмбрионы в 1 мл свежего PBT. Инкубируйте эмбрионы при 37 °C в течение 15 минут для подготовки к окрашиванию на LacZ. Пока эмбрионы инкубируются, приготовьте аликвоту 1 мл раствора для окрашивания X-gal.

Нагревайте аликвоту на водяной бане при 65 °C до появления помутнения. Затем перенесите ее в термоблок при 37 °C. После 15 минут прогрева эмбрионов удалите раствор PBT и замените его аликвотой 1 mL окрашивающего раствора.

Затем добавьте 20 µL субстрата X-gal. Инкубируйте пробирку при 37 °C в течение примерно двух-четырех часов при осторожном перемешивании до образования синего осадка. После этого удалите окрашивающий раствор и трижды промойте эмбрионы буфером PBT комнатной температуры.

После промывки с помощью игольчатого зонда или пинцета проведите ручную сортировку эмбрионов под диссекционным микроскопом. Соберите окрашенные эмбрионы, представляющие интерес, в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, используя пипетку объемом 1 мл. Затем промойте отобранные эмбрионы 0,4 мл PBT.

Затем замените PBT на 0,3 мл блокирующего раствора и инкубируйте эмбрионы в течение 15 минут при осторожном перемешивании. Через 15 минут добавьте 75 мкл первичных антител и продолжите инкубацию в течение ночи. На следующее утро промойте эмбрионы раствором PBT в течение примерно двух часов, меняя промывочный раствор каждые 30 минут.

После промывки добавьте 0,3 миллилитра блокирующего раствора, содержащего вторичные антитела, и инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение ночи при осторожном перемешивании. На следующее утро промывайте эмбрионы в PBT примерно три часа. Замените PBT не менее пяти раз за период промывки.

После промывки ресуспендируйте эмбрионы в 0,3 миллилитрах раствора DAB и добавьте два микролитра 3% hydrogen peroxide. Затем инкубируйте их в темноте при комнатной температуре, осторожно покачивая пробирку, до образования достаточного количества осадка. Обычно это занимает от 30 до 60 минут.

Затем четырежды промойте эмбрионы в PBT и перевзвесьте их в 0,2 миллилитрах закрепляющего раствора. После этого дайте эмбрионам уравновеситься в темноте при 4 °C. Для проведения филетирования эмбрионов разместите их на предметном стекле.

Сначала переместите их в каплю глицерина вентральной стороной вверх. Затем под диссекционным микроскопом отсеките переднюю часть и 1/4 длины тела, а также удалите самую заднюю область, не содержащую моторных аксонов. Теперь с помощью игольчатого зонда извлеките препарат из глицерина, разверните его дорсальной стороной вверх и расположите горизонтально в поле зрения.

Следующий этап требует использования тонкой вольфрамовой иглы, вставленной в полость игольчатого зонда и согнутой на конце. С помощью вольфрамовой иглы сделайте небольшой разрез на заднем конце эмбриона и продолжайте надрезать по дорсальной срединной линии. Убедитесь, что кончик вольфрамовой иглы не касается поверхности предметного стекла во время диссекции, так как игла может легко согнуться о стекло.

Затем с помощью зонда верните препарат в каплю глицерина и расположите его спинной стороной вверх. После этого отделите кишечник от стенки тела, разворачивая каждую стенку тела в вентролатеральном направлении. Две стенки тела должны разойтись.

Теперь с помощью зонда осторожно перенесите лоскуты стенки тела на предметное стекло. На стекле с помощью вольфрамовой иглы удалите внутренние органы, смещая их латерально. Чтобы зафиксировать вольфрамовую иглу и предотвратить ее повреждение, вставьте ее в полую иглу-наконечник и прижимайте вольфрамовую иглу к поверхности предметного стекла во время манипуляций.

Теперь закрепите препараты в 8 µL закрепляющего раствора на новом предметном стекле. Накройте покровным стеклом и запечатайте края обычным лаком для ногтей. Затем получите изображения с высоким разрешением, используя оптику DIC.

С помощью описанного метода эмбрионы 16-й стадии были окрашены антителами к Fas2 и подготовлены для визуализации моторных нейронов и абдоминальных гемисегментов A3 и A4. В норме не менее семи моторных нейронов вытягивают и фасцикулируют свои аксоны для формирования ветви межсегментного нерва ISNb. В данной подготовке также можно было идентифицировать многие окружающие нервные пучки. Когда межсегментный нервный пучок достигает точки разветвления у мышц 6 и 7, два аксона селективно дефасцикулируют и иннервируют мышцы 6 и 7.

То же самое происходит и в других точках выбора по мере распространения пучка в дорсальном направлении. Затем, в последней точке выбора, два аксона иннервируют мышцу 12. Напротив, в эмбрионах с мутацией Sema-1a эти же аксоны не подвергаются дефасцикуляции в своих точках выбора.

Это не является неожиданным, так как известно, что белок Sema-1 aegean способствует формированию связей между двигательными аксонами и целевыми мышцами в процессе развития нервной системы. Таким образом, описанный метод может быть использован для анализа фенотипов мутантов. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить сортировку нужных эмбрионов-мутантов, как выполнять иммуноокрашивание паттернов аксональных проекций двигательных нейронов и как препарировать фиксированные эмбрионы для создания плоских препаратов.